| 研究課題/領域番号 |
25640085
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
浅野 竜太郎 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
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| 研究分担者 |
梅津 光央 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (70333846)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 癌 / 蛋白質 / バイオテクノロジー / 生物・生体工学 / 四重特異性四価抗体 |
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| 研究概要 |
低分子二重特異性抗体は、高機能性と低分子性を兼ね備えた魅力的な分子であり、次世代抗体医薬の形態として期待されているが、通常のIgG型の抗体に比べて、結合価数と体内半減期が減少することが大きな問題となっている。本研究は、これらを多量体化により解消し、さらに合計4種類の抗体を用いることで、その多量体構造を完全に制御すると同時に、複数の機能性抗体の相加・相乗効果により、飛躍的に薬効を高めた低分子四重特異性四価抗体の創製を目的としている。
本年度は、以前に開発したガン関連抗原として上皮増殖因子受容体(EGFR)、T細胞表面抗原としてCD3を標的としたEx3と名付けたdiabody型低分子二重特異性抗体を基盤に、NK細胞表面抗原であるCD16への特異性も付与させた三重特異性四価抗体(EGFR/CD3-EGFR/CD16)の構築を進めた。三重特異性四価抗体の調製に必要な4種の遺伝子を全て共発現させると、Ex3および抗CD16抗体と抗EGFR抗体から成るEx16 diabodyが優先的に調製される可能性がある。そこで抗EGFR抗体を対角に配置する様に設計した2種のヘテロdiabodyを個別に調製後、試験管内で混合させ、交換反応による三重特異性四価抗体の再構成を目指した。2種のヘテロdiabody発現ベクターをそれぞれ作製し、大腸菌発現系を用いて調製した結果、菌体内から調製した分子には夾雑物が多く含まれていたものの、培地上清とペリプラズム画分からは純度の高い分子を調製することができた。続いて、これらを等モル混合させ静置させた後のサンプルを用いて、ガン細胞傷害性試験を評価したところ、活性はみられたものの、混合前と比べて優位な活性の増強はみられなかった。今後、その要因を探ると共に、改善に向けた静電斥力が働くような荷電性アミノ酸ペアの導入や、ジスルフィド結合の導入も視野に入れて進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Ex3と名付けたdiabody型低分子二重特異性抗体を基盤に、NK細胞表面抗原であるCD16への特異性も付与させた三重特異性四価抗体(EGFR/CD3-EGFR/CD16)の開発に向けて、予定通り発現ベクターを作製し、大腸菌を用いて組換え体を調製後、ガン細胞傷害性試験へと進めることができた。一方で、傷害活性はみられたものの、混合前と比べて優位な活性の増強はみられず、その要因のひとつとして、実際には期待する三重特異性四価抗体が再構成されておらず、本来は活性を示さないと予想されるヘテロdiabodyが何らかの要因で活性を示したことが考えられる。即ち、ヘテロdiabody自体が比較的安定な二量体を形成し、混合のみでは交換反応が促されなかった可能性が考えられる。そこで、今後は解離を促すような静電斥力を生み出す荷電性アミノ酸ペアの導入や、一方で、解離を防ぎたいドメインには、ジスルフィド結合の導入を進める予定であり、それに向けた調査、情報収集を既に開始している。三重特異性四価抗体の調製に向けては、予定通り進めることができたが、期待する効果が得られなかったこと、またその改善策として一部予定を変更して調査、情報収集に着手したことを鑑みて、おおむね順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に引き続き、三重特異性四価抗体(EGFR/CD3-EGFR/CD16)の開発を進める。荷電性アミノ酸ペアの導入などによりヘテロdiabodyの解離が促進されると、再会合による三重特異性四価抗体の調製確率が高まる一方で、全てを共発現させた場合と同様に、Ex3とEx16の混在が懸念される。そこで、EGFR/CD3-EGFR/CD16の調製が困難な場合は、例えば他のリンパ球表面抗原抗体として抗CD28抗体や、ガン関連抗原抗体として抗CEA抗体を用いた三重特異性四価抗体の調製などに切り換えて進める。また最終目的である四重特異性四価抗体は、三重特異性四価抗体の調製時とは異なり、Ex3などの二量体diabodyは、原則生成されない。そこで、三重特異性四価抗体の開発と並行して四重特異性四価抗体の開発も進める予定である。まず4種のヘテロscFvの共発現を試みるが、抗体種が増えることで、異種抗体間での会合の可能性も増加する。このため配向性や変異導入に加えて、リンカー長等も考慮しながら研究を進める。一方で4種のヘテロscFvの発現量を揃えることは困難が予想されるため、前年度同様にヘテロdiabodyとして調製後、試験管内での再構成も並行して、例えば弱いタンパク質変性剤やカオトロピックイオンを用いたドメインスワッピング条件の検討も進める。また抗体の組み合わせ検討も進め、四重特異性四価抗体を調製可能であることをまず示すことに重点を置き、大腸菌発現系だけではなく、動物細胞発現系の利用も考えている。得られた人工抗体の機能評価は、第一に抗腫瘍効果を考えているが、使用するガン細胞の標的抗原の発現の有無、共発現の場合は発現度合いの比等も算出し、具体的に期待するような複数の抗原を標的とすることによる相加・相乗効果が得られているかの確認も行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度の研究計画に於いて、三重特異性四価抗体の調製と機能評価を効率的に進めたことで生じた。
未使用額は平成25年度の研究計画に於いて、三重特異性四価抗体の調製と機能評価を効率的に進めたことで生じたものであるが、一方で、調製した三重特異性四価抗体が期待する活性を示さなかったことから、本年度は平成26年度請求額と併せて、その要因の検討や改善・改良のための分子デザインに充当したいと考えている。また大腸菌発現系では複数の遺伝子の共発現が困難であるため、平成25年度は、最小単位のヘテロdiabodyとして調製後、試験管内で混合させ、交換反応による三重特異性四価抗体の再構成を目指した。平成26年度は、四重特異性四価抗体を調製可能であることをまず示すことも重要と考えており、そのために必要な動物細胞発現系の利用や、効率的に開発を進めるための、デザインした遺伝子の全合成にも、平成25年度の未使用額を用いたいと考えている。
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