研究課題
ゲノムワイドなshRNAを発現するレンチウイルスライブラリーを用いたスクリーニング系の確立を行った。平成25年度までに作製した8000クローンからなるレンチウイルスを感染した10種類のヒト大腸がん細胞感染プールを用いて、siRNAのトランスフェクションによりTACC3を枯渇させた。その結果、一つのプールから増殖する細胞集団が確認された。これらの細胞集団は、再度のTACC3 siRNAのトランスフェクションにおいても増殖が確認されている。樹立されたオルガノイドに対するレンチウイルスの感染法を確立した。EGFPを発現するレンチレンチウイルスベクターを作製、オルガノイドを個々の細胞に消化した後、サイトスピンを用いる事により、効率良く感染した。さらに、薬剤処理を行い非感染細胞を排除することにより、継続してマーカー遺伝子を発現するオルガノイドの取得が可能となった。Tacc3S/S, ApcS/S, R26CreERTおよびTacc3W/W, ApcS/S, CreERT2の遺伝子型をもつマウス消化管から樹立したオルガノイドを用いて、マイクロアレイによる網羅的発現遺伝子解析を行った。その結果、Apc遺伝子の単独欠損では、Lgr5などの腸管幹細胞マーカーの亢進が観察された。さらにTacc3を欠損させると、発現亢進が抑制される事が明らかになった。
3: やや遅れている
大腸がん細胞を用いたshRNAスクリーニングでは、候補クローンが取得されており、予定通り進行している。オルガノイドに対するレンチウイルス感染法の最適化を行ったが、8000クローンからなるウイルスプールを均等かつ効率よく幹細胞に感染するために、更なる最適化が必要である。遺伝子改変マウスから樹立されたオルガノイドは、in vitroでタモキシフェンを作用させることにより、効率的かつ迅速に遺伝子改変を行う事ができること、さらにApc遺伝子を破壊する事により、消化管幹細胞マーカーが亢進する事が明らかになり、消化管を構成する多様な細胞集団の増殖と分化に関して詳細な解析が可能となり、順調に推移している。
大腸がん細胞を用いたshRNAスクリーニングでは、Tacc3枯渇に対する反応性の特異性の検討、shRNAクローンの同定等を行い、Tacc3抑制により生じる増殖抑制回避機構を明らかにする。オルガノイドを用いたスクリーニングでは、ウイルスプールの感染法をさらに最適化し、スクリーニングを行う。遺伝子改変マウスから樹立されたオルガノイドを用いた解析では、qPCR等によるvalidationとTacc3欠損による消化管幹細胞の多様性および分化過程への変化を明らかにする。さらに、消化管幹細胞特異的な遺伝子改変を行い、オルガノイドで明らかにされたTacc3の機能を動物個体レベルで検証、新たな分子治療標的の開発を行う。
すべて 2014
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件)
Cancer Science
巻: 105 ページ: 1360-1368
10.1111/cas.12495.
