| 研究課題/領域番号 |
25650002
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
桂 進司 群馬大学, 理工学研究科, 教授 (10260598)
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| 研究分担者 |
大重 真彦 群馬大学, 理工学研究科, 准教授 (00451716)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ＤＮＡ複製 / １分子観察 / ＤＮＡ形態制御 / ＤＮＡ超らせん |
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| 研究概要 |
１分子解析技術を用いて、ＤＮＡ代謝反応制御における超らせん構造の役割を解析するためには、1分子レベルでの超らせん構造の導入システムを構築する必要がある。そこで、平成２５年度の研究により、1分子レベルでＤＮＡへ超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムを開発し、超らせん構造を導入したＤＮＡ分子の挙動を１分子レベルで解析することができた。
また、本研究では超らせん歪を導入したときのＤＮＡ複製起点近傍のＤＮＡ２次構造の変動に着目し、本研究で開発した超らせん導入システムと１本鎖領域標識のための蛍光ＲＰＡとを組み合わせることにより、超らせん構造の導入によるλＤＮＡの複製起点の二次構造変動の様子をリアルタイムに観察した。現在、これらの成果を学術論文として投稿する準備中である。
今後の研究に必要となる各種ＤＮＡ複製関連因子の蛍光標識の調製やSV40（Simian virus 40）の複製起点がクローニングされたλDNA（SV40ori-λDNA）などの鋳型DNAや各種酵素やタンパク質の作製は順調に進んでいる状態である。今後、複製起点近傍のＤＮＡ２次構造変動の精密解析やＳＶ４０ＤＮＡのin vitro複製系の再構成に必要な因子の調製、蛍光標識を進めていく予定である。さらに、蛍光標識した複製因子に基づき、ＤＮＡ複製系を顕微鏡視野内において１分子レベルで再構成し、そのときの超らせん構造の役割について解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２５年度のＤＮＡへ超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムの構築は完成しており、１分子レベルでの超らせん構造を導入したＤＮＡ分子の挙動を解析することができた。
構築した超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムを用い、超らせん歪導入時のＤＮＡ２次構造の変動をＤＮＡ複製起点に着目し解析を行い、超らせん構造の導入によりＤＮＡ複製起点の二次構造変動の様子を蛍光により解析できたため、ここまでの研究結果を学術論文にするためにまとめている状況である。
また、１分子観測に必要な各種ＤＮＡ複製関連因子の蛍光標識の調製やSV40（Simian virus 40）の複製起点がクローニングされたλDNA（SV40ori-λDNA）などの鋳型DNAなどDNAやの作製は順調に進んでいる状態であるため、ほぼ研究計画に沿いながらおおむね順調に進行していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回構築した超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムと蛍光標識されたＤＮＡ複製関連因子を用いて、再構成系において超らせん導入時におけるＤＮＡ複製反応を１分子レベルで可視化し、解析を進めていく。
具体的には、蛍光RPAなどによる構造変動の可視化とオプティカルマッピングとを組み合わせることにより、ウイルスやファージなどの複製起点近傍の構造変動をさらに詳細に解析し、ＤＮＡ複製開始とＤＮＡ複製バブル形成における超らせん構造の役割についての知見を深めていく。
また、SV40ラージT抗原や各種複製因子の蛍光標識化を進め、再構成系においてＤＮＡ複製フォークを観測を試み、そのときの超らせん構造の役割について解析を行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究の推進のために必須なＤＮＡポリメラーゼ合成の可視化およびヌクレアーゼ反応の可視化の実験を優先的に進めたために、一部の研究費を次年度に繰り越した。
昨年度から繰り越された予算も活用し、ＤＮＡ複製起点近傍の超らせん導入による構造変動解析およびＤＮＡ合成反応の可視化に関する研究を進める予定である。
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