転写伸長機構を介したDNAメチル化機構の解明

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25650007
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 木村 博信 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (60378891)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: DNAのメチル化機構 / 転写伸長因子

研究概要

次世代シーケンサーの登場によって、様々な細胞や組織のDNAメチル化模様が明らかになってきている。これまでDNAメチル化は転写抑制に働いていると考えられてきたが、転写が活性化状態にある遺伝子の遺伝子内領域が高度にメチル化されていることが明らかになった。私は、これまでにde novo型DNAメチル基転移酵素Dnmt3aと結合する因子の候補として転写伸長因子であるRPB1とSpt6を同定しており、転写伸長機構とDNAメチル化機構が協調して転写が活性化している遺伝子内領域のメチル化模様を形成すると考えている。
本年度は、Dnmt3aとRPB1相互作用を明らかにした。もう一つの候補因子であるSpt6との結合は確認できなかった。現在、細胞分化に伴いDNAメチル化される領域の解析をおこなっている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Dnmt3aと結合しているRPB1のリン酸化状態を明らかにし、転写伸長中のRPB1と結合している可能性を見いだした。さらに、Dnmt3aとリン酸化RPB1の結合にはRNAを介していないことを明らかにすることができた。Dnmt3aはSpt6と結合していないことを明らかにした。

今後の研究の推進方策

今年度では、細胞内においてDnmt3aとリン酸化RPB1が結合していることを明らかにすることができた。今後はリコンビナント蛋白質を作製し、in vitroでの結合実験をおこなっていく。また、RPB1のリン酸化は転写伸長に重要であることから、Dnmt3aは転写伸長中のRPB1と結合している可能性が高い。筋芽細胞C2C12の分化過程において、myod1遺伝子の発現開始と共に遺伝子内領域がメチル化されることから、myod1遺伝子領域に注目して、転写伸長機構とDnmt3aの関係を詳細に調べていく予定である。

次年度の研究費の使用計画

実験計画では、高価な培地を使用するマウス胚性幹細胞を用いた分化実験をおこなう予定であったが、低血清培地で分化実験が可能な筋芽細胞を用いた実験が可能かを検証しているため。
海外の国際発表をする予定にしていたが、もう少しデータを加えて発表した方がよいと考え、本年度の発表をおこなわなかった。
研究のクオリティーをあげるために、新たに次世代シーケンサーを用いた網羅的解析をおこなう予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The mTOR Pathway Controls Cell Proliferation by Regulating the FoxO3a Transcription Factor via SGK1 Kinase (2014)
  • 著者名/発表者名: Mori, S., Nada, S., Kimura, H., Tajima, S., Takahashi, Y., Kitamura, A., Oneyama, C., Okada, M.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9(2) ページ: e88891
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0088891
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell Cycle-Dependent Turnover of 5-Hydroxymethyl Cytosine in Mouse Embryonic Stem Cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Otani, J., Kimura, H., Sharif, J., Endo, T. A., Mishima, Y., Kawakami, T., Koseki, H., Shirakawa, M., Suetake, I., Tajima, S.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8(12) ページ: e82961
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0082961
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the versatile DNA recognition ability of the methyl-CpG binding domain of methyl-CpG binding domain protein 4. (2013)
  • 著者名/発表者名: Otani, J., Arita, K., Kato, T., Kinoshita, M., Kimura, H., Suetake, I., Tajima, S., Ariyoshi, M., Shirakawa, M.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 288 (9) ページ: 6351-6362
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.431098
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genome engineering of mammalian haploid embryonic stem cells using the Cas9/RNA system. (2013)
  • 著者名/発表者名: Horii, T., Morita, S., Kimura, M., Kobayashi, R., Tamura, D., Takahashi, R., Kimura, H., Suetake, I., Ohata, H., Okamoto, K., Tajima, S., Ochiya, T., Abe, Y. and Hatada, I.
  • 雑誌名: PeerJ 巻: 1 ページ: e230
  • DOI: 10.7717/peerj.230
  • 査読あり
• [学会発表] 細胞の形質を司るエピジェネティクス～DNAメチル化から考える～ (2014)
  • 著者名/発表者名: 木村博信
  • 学会等名: 第１８回関西大学先端科学技術シンポジウム
  • 発表場所: 大阪府関西大学
  • 年月日: 20140123-20140124
  • 招待講演
• [学会発表] Relative positions of 5-hydroxymethylcytosine and 5-methylcytosine at promoter correlate with the level of gene expression. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kimura, H., Suetake, I., Tooi, N., Kawakami, T., Thomoto, T., Aiba, K., Nakatsuji, N and Shoji Tajima
  • 学会等名: International Symposium on Transcription and Metabolism
  • 発表場所: 兵庫県淡路夢舞台
  • 年月日: 20131111-20131113
• [学会発表] マウスES細胞におけるヒドロキシメチルシトシンの産生と消去 (2013)
  • 著者名/発表者名: 木村博信、大谷淳二、川上徹、ジャファル・シャリフ、古関明彦、白川昌宏、末武勲、田嶋正二
  • 学会等名: 第7回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 奈良県新公会堂
  • 年月日: 20130530-20130531