| 研究課題/領域番号 |
25650009
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐藤 優子 大阪大学, 生命機能研究科, 特任研究員(常勤) (70435882)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / ヒストン修飾 / ライブイメージング / 細胞核 / 遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究は、ゲノムDNA上の特定の領域を生細胞で可視化する新しいプローブを開発し、細胞分化過程における特定の遺伝子領域のエピジェネティクス動態を観察することを目的として行っている。平成25年度は、生細胞中で内在性ゲノム領域を可視化するためのプローブ作製を試みた。まず、任意の特異的配列を認識して結合するTranscription Activator-Like Effectors (TALEs)を設計するための標的配列候補を、ヒトおよびマウスのゲノムDNA配列から探索した。DNA配列の網羅的解析から、ヒトおよびマウスのゲノム配列上には、中程度に反復する（101～105回）配列が全域にわたって散在することがわかった。この中から、領域特異的に存在する反復配列を抽出し、ヒト第9番染色体上の80回反復配列、およびマウスX染色体上の129回反復配列に注目した。これらの配列に特異的に結合するGFP融合型TALEタンパク質発現ベクターを作製し、ヒトおよびマウス由来の培養細胞へ導入して生細胞の蛍光観察を行った。各培養細胞に発現させたヒト第9番染色体およびマウスX染色体検出用GFP融合TALE（GFP-TAL-h9およびGFP-TAL-mX）は、培養細胞中で細胞核内への局在がみられたが、予想に反して多くの分子が核小体へ濃縮されていた。また核小体以外のfociにも蛍光シグナルがみられたが、Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)による解析の結果、非常に結合時間が短く、非特異的結合であることが示唆された。したがって、今回注目したヒトおよびマウスの配列は、領域特異的な可視化には適していないことが示唆された。今後、異なるDNA領域についても検討していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
生細胞可視化のための蛍光プローブが、核小体へ局在しやすい傾向がある事が判明した。またプローブの標的配列として設定した配列が、遺伝子領域特異的な可視化に適切でない可能性が示唆された。研究目的の達成には、これらの問題点を解決することが必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子領域の可視化プローブとして、Crisper-Cas9システムを導入する。本システムでは、gRNAによりプローブの局在化することが可能である。gRNAは比較的安価に合成することが出来るため、複数の標的候補配列を検討できる。既に抽出したヒトおよびマウスゲノムDNA配列上の、中程度反復配列を複数試すことで、目的に合ったプローブを作製できると考える。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の研究計画通りの結果が得られず、方針を変更したため。
任意の遺伝子領域を生細胞で可視化するため、Crisper-Cas9システムによる新たな蛍光プローブを作製する。遺伝子領域プローブとヒストン修飾プローブを組み合わせて、任意の遺伝子領域におけるヒストン修飾動態を、生きた細胞の中で経時的に観察する。
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