研究課題
本研究では、申請者の独自の発見「Rif1はクロマチンループ構造の形成を介して複製タイミング機能ドメインを規定する」に基づき、Rif1を用いてクロマチンループ構造の人為的改変を介して核内構造を操作し、細胞の機能改変を誘導する新規技法を開発する。Rif1を用いて、染色体の核内配置や高次構築を操作するために、1) 発現レベルを変動することによりゲノム全体のクロマチンループ構造を操作する、2) 部位特異的にクロマチンループを形成し、局所的に染色体機能ドメインを操作する、の二つのアプローチをとる。1)についてまず分裂酵母を用いてRif1増産の影響を解析した。さらに2)を達成するために、Rif1タンパク質のDNA結合能について解析を行ない下記の結果を得た。(1)分裂酵母でRif1を増産すると核内染色体構造の異常が誘導され、著しい増殖阻害が観察された。このことはRif1を用いて染色体配置を操作するためにはその産生レベルを厳密に制御する必要があることを示唆する。(2)分裂酵母色体上のRif1結合部位はグアニン４重鎖(G4)構造を形成する。さらに、精製された分裂酵母Rif1はG4構造に特異的に結合する。動物細胞のRif1も同様にG4構造に結合する。この知見に基づき、G4構造を染色体上に導入し、Rif1により染色体高次構築を操作するという戦略を考えている。
2: おおむね順調に進展している
これまでに、分裂酵母および動物細胞のRif1タンパクを増産精製することに成功し、それらがグアニン４重鎖構造に結合することを発見した。また変異体の解析からC末端がRif1の核膜局在、オリゴマー形成に重要であることを見いだしている。分裂酵母におけるRif1増産が染色体構造に及ぼす影響を解析した。
Rif1がグアニン４重鎖結合タンパクであるという新規知見に基づき、４重鎖構造を染色体上に導入することにより、染色体の局所的な高次構造を変化させるという戦略に至った。さらにグアニン４重鎖結合ドメインの同定、他のDNA結合ドメインとのswappingなどを組み合わせ、Rif1の機能ドメインの同定と、染色体の核内配置や高次構築を操作する新規技法の開発をめざす。
思っていたより安価で消耗品を購入できたため。
研究補助員の謝金、G4DNA の化学合成・放射性同位元素・分子生物試薬の購入
研究成果の一部については 東京都医学総合研究所 ゲノム医科学研究分野 ゲノム動態プロジェクトのホームページ（http://www.igakuken.or.jp/genome/） において紹介しております。
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