| 研究課題/領域番号 |
25650032
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
長田 俊哉 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (00201997)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | GPCR / 分裂酵母 / フェロモン / GFP |
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| 研究概要 |
分裂酵母を用いて外来性GPCRを発現させるためのレポーター株を構築した。分裂酵母は哺乳類のMAPK経路に似たGPCR経路を持つことが確認されており、このシグナル経路を通じて最終的にレポーター遺伝子が発現する株を作成した。まず染色体上経路特異的に応答する遺伝子のOpen Reading Frame（ORF）を緑色蛍光タンパク質（GFP）と置換した。シグナル経路特異的にGFPを生産させることには成功したが、応答が弱すぎたため陽性と陰性の差があまりみられなかった。この問題を解決するために、レポーター領域をプラスミド上に導入し、コピー数を増加させることで応答を上昇させた。GFPの制御領域はシグナル経路特異的に上昇する7種類の遺伝子の上流領域を使用した。下流領域にヒトリポコルチンI（LPI）ターミネーターを使用した場合、mam2上流領域はバックグラウンドも高かったが最も強く応答した。次に下流領域をLPIターミネーターではなく7種類の遺伝子の下流領域に組み替えた場合、LPIターミネーターと比較して、SPBC4.01の下流領域は応答を上昇させた。そこでSPBC4.01の下流領域をその他の上流領域と組み合わせたとき、sxa2の上流領域との組み合わせはリガンドに対する応答のみを上昇させ、すべての株の中で最も良いシグナル・ノイズ比を示した。
今回開発したレポータープラスミドは、高感度で非常に扱いやすいものであった。これらのレポータープラスミドはGPCRを含むインテグラルベクターと同時に導入しても高い形質転換効率を示した。染色体上にlacZを導入する方法と比較すると高感度検出のための処理を省略できた点はアッセイの効率化に大きく寄与できたと考えられる。ただし、レポーター遺伝子が高コピープラスミド上に位置しているため、プラスミドのコピー数が一定でなく、一細胞あたりの蛍光量にばらつきが生じてしまった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分裂酵母は2つのGPCR経路をもち、一つはグルコースを感知するための経路で哺乳類のcAMP経路に似ている。もう一つは接合シグナル経路で哺乳類のMAPK経路に似ている。グルコース感知経路では、Git3（GPCR）がGpa2（α）・Git5（β）・Git11（γ）三量体と共役し、Cyr1（ACIII）を介して細胞内のcAMP濃度が上昇する。接合シグナル経路ではMam2/Map3（GPCR、酵母フェロモン受容体）にP因子/M因子（フェロモン）が結合すると受容体の構造が変化しGpa1（Gα）と共役する。
これらの二つの経路についてリガンドアッセイ系を構築することにより、分裂酵母がより広範囲に外来性のGPCRのリガンドアッセイ系に使えるもとと期待される。初年度のもっとも重要な課題であった分裂酵母の接合シグナル経路を用いたフェロモンアッセイ系の構築はほぼ完成した。初年度の予定では接合シグナル経路でのリガンドアッセイ系の構築と外来性のGPCRの酵母でも発現も予定していたが、後者の点についてはまだあまり実験が進んでいない。これは二年度以降に予定していたグルコース感知系のリガンドアッセイ系の構築を初年度に前倒しで始めた方がよいと前述の理由により判断し直したため、外来性GPCRの発現解析が後回しになった。分裂酵母のグルコース感知系のリガンドアッセイ系については２年度中での構築にほぼめどがたってきたので、３年のプロジェクト全体の流れとしてはほぼ順調に来ていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度はグルコース感知系のリガンドアッセイ系の開発、mam2異所発現株の作成、mam2とgit3ハイブリッドタンパク質の作成を行う。一番めについては前述したので、二番目と三番めについて述べる。
mam2異所発現株の作成
外来性のGPCRを分裂酵母に発現させる場合に、発現量が多すぎると細胞に悪影響を与えてしまい、また発現量が少なすぎるとシグナル応答が弱くなってしまうことが予想される。適度な発現量を見つける必要があるが、外来性のGPCRを使って行うには、機能的に発現できるかなど別の問題も絡んでくるため、酵母のGPCRであるmam2をノックアウトし、その後異所性にmam2発現させ、レポーターアッセイで最適条件を検討する。具体的には、数種類のプロモーターを使い、染色体上及びプラスミド上でmam2を発現させ、比較検討する。
mam2とgit3ハイブリッドタンパク質の作成
外来性GPCRを分裂酵母に発現させる場合に、酵母のGタンパク質との共役がうまく行われるかなど検討する必要がある。分裂酵母にあるGPCRはフェロモン系(mam2など)がGpa1とグルコース系(git3)がGpa2とそれぞれのGαサブユニットと共役することがわかっている。そこでmam2とgit3ハイブリッドタンパク質の作成を作成し、Gタンパク質との共役部位を特定する。具体的にはmam2のC端や細胞内ループ部位をgit3で置換し、Gpa1からGpa2へ共役するハイブリッドタンパク質を作成する。同様にして、git3のC端や細胞内ループ部位をmam2で置換し、Gpa2からGpa1へ共役するハイブリッドタンパク質を作成する。これらの実験から分裂酵母のGPCRのGタンパク質共役部位が特定され、外来性のGPCRが酵母のGタンパク質とうまく共役できない場合に、外来性のGPCRと酵母のGPCRのハイブリッドタンパク質の作成することが可能になる。
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