|
本プロジェクトは哺乳類GPCRを利用したバイオセンサーの開発および哺乳類GPCRのオーファン受容体のリガンド探索スクリーニングシステムの開発を目指して行われた。ホスト細胞としては動物細胞と比べて遺伝子導入・欠損や飼育が容易である酵母を選択した。さらに出芽酵母を含むすべての酵母の中でも進化、脂質修飾様式、遺伝子相同性といった観点において最も哺乳類に近い特徴を持つという理由から分裂酵母を用いた。
分裂酵母の２つのGPCR経路(接合フェロモンシグナル伝達経路とグルコースシグナル伝達経路)のリガンド応答のシグナルの定量的な評価が可能なアッセイ法を確立した。接合フェロモンシグナル伝達経路では、伝達経路の下流で発現するタンパク質をGFPに置換することで、酵母のフェロモンシグナルの定量的な評価が可能になった。グルコースシグナル伝達経路の場合も同様に下流にGFPを置くことで、アッセイ系を確立した。グルコースシグナル伝達経路の場合はフェロモン系とは逆に、シグナル伝達により発現が抑制されるタンパク質のプロモーターを利用した。このためこのグルコースシグナル伝達経路では、通常GFPを発現していて、グルコースを受け取ると、GFPの発現が押さえられることにより、リガンド応答の有無が行える。
接合フェロモンシグナル伝達経路で働くGαサブユニットGpa1は、哺乳動物のGαサブユニットGiと類似点が多いことから、Giに共役したGPCR発現解析に有効と思われる。一方、グルコースシグナル伝達経路で働くGαサブユニットGpa2は、哺乳動物のGαサブユニットGsと類似点が多いことから、Gsに共役したGPCR発現解析に有効と思われる。今後分裂酵母の２つのGPCR経路を用いて、哺乳類GPCRのリガンド検索を行っていきたい。
|
