重原子標識脂質を導入した膜タンパク質構造解析技術の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25650051
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 杉山 成 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90615428)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 膜タンパク質結晶 / バイセル / 重原子標識脂質 / 結晶成長 / 重原子誘導体結晶 / 溶液撹拌法 / Ｘ線構造解析 / 脂質

研究実績の概要

膜タンパク質は、脂質二重膜の中で脂質との相互作用によって初めて機能が発揮される。それにも関わらず、Ｘ線構造解析に必須となる結晶化の際には、界面活性剤で脂質二重膜を取り除き、脂質分子の不在による構造の不安定化を認識しながら半ば強引に可溶化、精製、結晶化および構造解析を行ってきており、現在もそれが主流となっている。それ故に、膜タンパク質の結晶化における脂質の重要性は「分検討されてこなかった。対照的にバイセルを用いた結晶化法は、脂質二重膜中の構造を反映した形で膜タンパク質を再構成することができる。従って、従来の界面活性剤に取り囲まれた不自然な状態と比べると犬きく構造が安定化される。　しかし、その適用例は現在までに5例と極めて少ない。　本研究では、これらの問題を解決するため、新規バイセルを用いた脂質制御による全く新しい膜タンパク質結晶化技術の開発を行った。また、解析に必要な位相問題を解決するため、重原子で標識化された脂質によって調整されたバイセルを用いて、構造の安定化と同時に、脂質の重原子によって位相問題を解決する技術開発を行った。本年度は次の実験を行った。
臭素（Br）原子で標識化したBr-DMPCとCHAPSOを用いて、先で開発した高品質結晶化技術を適用し、bR/Br標識バイセル結晶を取得することに成功した。具体的には、シンクロトロン放射光を用いたＸ線吸収微細構造測定によってBr標識脂質の存在を初めて確認した。また、同時にＸ線回折データを取得し、差フーリエ図によってBr原子位置を観察することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography (2015)
  • 著者名/発表者名: Michihiro Sugahara, Eiichi Mizohata, Eriko Nango, Mamoru Suzuki, Tomoyuki Tanaka, Tetsuya Masuda, Rie Tanaka, Tatsuro Shimamura, Yoshiki Tanaka, Chiyo Suno, Kentaro Ihara, Dongqing Pan, Keisuke Kakinouchi, Shigeru Sugiyama, Michio Murata, Tsuyoshi Inoue, et. al.
  • 雑誌名: Nat. Method 巻: 12 ページ: 61-63
  • DOI: 10.1038/nmeth.3172
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic studies of PotA, a membrane-associated ATPase of the spermidine-preferential uptake system in Thermotoga maritima (2014)
  • 著者名/発表者名: Shigeru Sugiyama*, Keiko Kashiwagi, Keisuke Kakinouchi, Hideyuki Tomitori, Ken Kanai, Michio Murata, Hiroaki Adachi, Hiroyoshi Matsumura, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Yusuke Mori and Kazuei Igarashi
  • 雑誌名: Acta Crystallogr., F 巻: 70 ページ: 738-741
  • DOI: 10.1107/S2053230X14008607
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] 膜タンパク質研究基盤の構築に向けた合成リン脂質の利用 (2015)
  • 著者名/発表者名: 1.杉山成, 斎木悠, 島田真典, 垣ノ内啓介, 新山真由美, 花島慎弥, 溝端栄一, 井上豪, 松森信明, 村田道雄
  • 学会等名: 第15回蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県、徳島市）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [学会発表] 重元素化脂質含有バイセルを用いた膜タンパク質結晶化法の検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 斎木悠，花島慎弥，村田道雄，松森信明，溝畑栄一，井上豪，川竹悟史，垣之内啓介，杉山成
  • 学会等名: 日本化学会 第95春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス（千葉県、船橋市）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] バクテリオロドプシンを機能的に再構成する膜脂質の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 川竹悟史、梅川雄一、松岡茂、杉山成、園山正史、村田道雄
  • 学会等名: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜（神奈川県、横浜市）
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-27