| 研究実績の概要 |
異なる２つのタンパク質分子がナノレベルで近接して分布する細胞内部位を電子顕微鏡で可視化するために、広い領域の膜分子分布を観察できる急速凍結・凍結割断レプリカ標識(QF-FRL)法を用いて検討を行った。前年度にモデル実験系として作製したSte2pのＣ末欠失変異体（Ste2pΔTail）を発現する出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeを引き続き用いて、条件検討を継続した。ビオチンリガーゼBirAおよびその基質となるペプチドAPまたはAviTagTMをSte2pΔTailの細胞質側ドメイン末端に結合させたコンストラクトのcDNAをGPDプロモータの下流につないだプラスミドを酵母に導入し、強力に発現を誘導した。酵母の凍結割断レプリカを作製し、Zymolyaseで処理して細胞壁を取り除いたのち、ATP, biotin, Mg2+存在下で浸漬してビオチン付加を誘導した。凍結割断レプリカをSDSで一晩処理して残存する膜以外の成分を取り除き、抗ビオチン抗体、金コロイド標識二次抗体を作用させて電子顕微鏡観察した。このプロトコールでは前年度よりも対象分子の発現量が増大したが、凍結割断レプリカ上の金コロイド標識はごく僅かであり、また期待される細胞膜の内葉（細胞質側膜葉）だけでなく、細胞膜の外葉や細胞外などにも同様の密度で分布したため非特異的な結合の可能性が高いと考えられた。この結果はAP, AviTagTMのどちらを用いた場合も変わらなかった。凍結、レプリカ作製、Triton X-100処理のいずれかの操作過程でBirAの活性が失われた可能性が高い。当初の研究目的を達成するためにはBirA以外の酵素の使用を検討すべきと考えられる。
|
