研究課題
生殖細胞系列は次世代に遺伝情報を伝達し、生命の連続を保証する唯一の細胞種である。このため、生殖細胞の発生にはゲノムの正確な複製や、減数分裂による多様化とともに、全個体を完全に発生させる能力の獲得が含まれる。生殖細胞の起源は始原生殖細胞であり、胚発生の初期に多能性の上皮様組織（エピブラスト）から分化して生ずる。興味深いことに、始原生殖細胞を一定の条件下で培養すると、ES細胞やiPS細胞と同様の分化能をもつ多能性幹細胞(Embryonic Germ Cell：EG細胞)へと分化する。また、多能性幹細胞の基盤転写因子Oc4やNanogの発現は、生体内においては、初期胚を除けば生殖細胞系列にほぼ限定される。すなわち始原生殖細胞は、多能性のエピゲノム的基盤を保持し、潜在的に保ちながら、その顕在化を抑制しているといえる。本研究の目的は、私が確立した微量試料からの転写因子ChIP-seq法によって、始原生殖細胞における多能性幹細胞の基盤転写因子群(OCT3/4, SOX2, NANOG)の結合部位を同定し、始原生殖細胞の多能性の分子基盤を確立するとともに、その顕在化を抑制する機構を解明することである。本年度は、もっとも重要な多能性関連因子、Oct3/4について、昨年度までに確立したモノクローナル抗体やEGFPタグOct3/4を用いて、ES細胞(Embryonic stem cells; ESCs)、Epiblast Like Cells(EpiLCs)に対するChIP-seq解析を行った。
2: おおむね順調に進展している
本年度は抗Oct3/4抗体および、EGFPタグ付きOct3/4を用い、少数細胞からのOct3/4のChIP-seq解析を行った。私はすでに、別の転写因子Blimp1にEGFPをタグし、そのノックインマウスを作成し、妊孕性のある正常な個体を得ている。このことからEGFPタグは、転写因子Blimp1の機能を阻害しないことがあきらかであり、他の転写因子についても生理的活性を保持することが期待される。また、EGFP-Blimp1を用いたChIP-seqでは非常に良好なピークを得られており、この点でもEGFPタグは転写因子ChIP-seqのコントロールとして適しているといえる。Oct3/4のChIP-seqの結果、EGFPタグしたOct3/4を抗GFP抗体を用いて得られたデータと、タグなしOct3/4をマウスモノクローナル抗Oct3/4抗体を用いて得られたデータには一貫性が見られた。このことから、少数細胞からOct3/4のモノクローナル抗体を用いたChIP-seqが機能していることが示唆される。しかしながら、その一方で、Oct3/4のモノクローナル抗体を用いたChIP-seqでは、EGFPタグを用いたときよりも一貫して高いバックグラウンドが見られ、免疫沈降効率とその特異性の改善が必要であることが問題として示された。
抗Oct3/4モノクローナル抗体を用いたChIP-seqでは10^5個程度の数の細胞に対しては、一定の質を保ったデータを得ることができることが示されている。本年度はこの情報をもとに、PGCまたはPGCの試験管内モデル系（PGC-like cell; PGCLC）へと応用するとともに、現状の問題であるバックグラウンドの低下に取り組みたい。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 2件)
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