微小管プラス端集積因子（+TIPs）依存的な新規物質輸送機構の探索

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25650071
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 清末 優子 独立行政法人理化学研究所, 発生・再生科学総合研究センター, ユニットリーダー (90568403)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 細胞骨格 / 微小管 / 微小管プラス端集積因子 / 物質輸送 / 分泌

研究概要

本研究課題では、細胞内交通インフラ“微小管細”胞骨格を配置しこれを利用することで発生や健康の維持に関わる生体活動を調節する、新たな分子機構の解明を目指している。
本研究者の先行研究において、微小管の先端の位置決めに重要な役割を果たす分子群“微小管プラス端集積因子 (+TIPs)”を見出してきた。+TIPsの中心分子End-Binding 1 (EB1)は、CLASPやAPC癌抑制因子等の細胞表層結合タンパク質と微小管先端で複合体形成してプラス端を細胞表層につなぎとめる。このプラットホームが荷物の積み下ろしや選別に重要な役割を果たしていると仮定し、+TIPs依存的な分泌因子の探索とその機能解明を培養細胞系とマウスを用いて行っている。発生や病態の制御に重要な因子が特定できれば、治療や創薬の標的となり得る新しい輸送経路が発見されることになる。
まず、EB1、APC、およびCLASPを細胞表層に結合させるLL5等がshRNAにより恒常的にノックダウンされた細胞を樹立した。これらの細胞が培地中に分泌する分子を質量分析により分析したところ、いくつかの分子の存在量に変動が認められ、+TIPsが物質輸送に関与する可能性が確認された。次に、培養細胞系で特定された分子が個体レベルで機能しているかを調べるため、また一方で個体の表現型から+TIPsが輸送を制御する物質を特定するため、+TIPsに変異を持つマウスの作製と解析を進めた。APC変異マウスは既存のAPC1638Tマウスを入手した。LL5sについては偶然にも自然発症変異マウスが発見されたためこのマウスを入手した。さらに、EB1変異を持つマウスを作製するため、高効率ゲノム編集ツールCRISPR/Cas9システムを用いてEB1遺伝子を切断する系を構築した。変異マウスを用いたこれまでの予備実験では、ホルモンや分泌因子の不足に関連した発育遅延や代謝異常が検出され、所期のコンセプトが確かめられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

培養細胞系とマウスの両面からの解析により、+TIPsに依存的な分泌因子の存在と、+TIPs機能の個体レベルでのインパクトが確認され、所期の目標をほぼ達成した。今後この研究成果を発展させるために重要な礎石となる発見であり、着実な進捗がある。さらにこの発見は、エイジングや妊娠時のホルモン調節に関わるものであり、少子高齢化問題を抱える現代人類の生活の質の向上に関係し重要性が高まっている領域に属する。将来の発展にも期待がかかる。

今後の研究の推進方策

次年度は、APCとLL5に関する解析結果をとりまとめ成果報告を行う。またCRUSPR/Cas9システムを利用したEB1ノックアウトマウスの作製を進め、解析を継続する。
LL5はアンチエイジング作用を有する因子の分泌を促進するため、この経路の活性化は健康増進に役立つと期待される。これを実現するためには、まず、1) モデルマウスを用いてコンセプトの妥当性検証を行い、2) 培養細胞系でLL5経路を活性化し得るメカニズムの探索を進めていく必要がある。1)については、現在RFP融合LL5ノックインマウスを作成中であるので、外来LL5の発現が十分に高ければLL5の過剰発現が結構増進に効果を及ぼし得るかどうかを検証することができる。また、エイジングに関するモデルマウスを利用して、LL5の変異又は過剰発現が症状に及ぼす効果の調査も有効である。LL5が有望であれば、その機能を制御する方法については培養細胞系で細胞生物学的手法を用いて詳細に調べ、創薬や治療の戦略を検討することができる。APCに関しても同様に、本研究で見出した新規機能が治療の標的として適しているかどうかの検証を行う。
今後、本研究の成果を研究を継続・発展させる次プロジェクトのための資源獲得を進める。

研究成果

• [雑誌論文] CFEOM1-associated kinesin KIF21A is a cortical microtubule growth inhibitor. (2013)
  • 著者名/発表者名: van der Vaart B, van Riel WE, Doodhi H, Kevenaar JT, Katrukha EA, Gumy L, Bouchet BP, Grigoriev I, Spangler SA, Yu KL, Wulf PS, Wu J, Lansbergen G, van Battum EY, Pasterkamp RJ, Mimori-Kiyosue Y, Demmers J, Olieric N, Maly IV, Hoogenraad CC, Akhmanova A.
  • 雑誌名: Dev Cell. 巻: 27 ページ: 145-160
  • DOI: 10.1016/j.devcel.2013.09.010.
  • 査読あり
• [雑誌論文] スピニングディスク共焦点顕微鏡の改良と組織・個体内部の観察への応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 下澤東吾, 清末優子.
  • 雑誌名: 生体の科学 巻: 64 ページ: 564-570
• [備考] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.cdb.riken.jp/oia/
• [備考] [報道発表資料] 生物内部を高速・高精細にイメージングが可能に
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2013/20130212_1/