| 研究課題/領域番号 |
25650074
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
千原 崇裕 東京大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (00431891)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現 / ショウジョウバエ / 樹状突起 / ターゲティング / 神経発生 |
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| 研究概要 |
平成25年度は、「脳内で任意に標識した神経細胞の遺伝子発現プロファイル」を行うための準備として、「脳内の任意神経細胞の標識」を中心に研究を進めた。
まず、光活性化GFP (Photoactivatable GFP: PA-GFP)を用いて特定の投射神経標識を試みた。解剖後の脳マウント法、レーザー強度の調節など様々な条件を検討した結果、最終的に特定のPNを標識することが可能になった。しかし、その成功率は低く、実際に脳神経細胞を分散して回収するのに十分な簡便さを得ることはできなかった。よって、次に示す遺伝学的方法による投射神経標識を試みた。
ショウジョウバエにはGal4/UAS, LexA/LexOP, QF/QUAS法など様々な遺伝子過剰発現法が存在する。特に私は、Gal4/UAS法とFLP/FRT法を組み合わせることにより、一部の投射神経を特異的に標識することを試みた。様々なGal4, FLPの組み合わせを試すことにより、一部の投射神経を標識するのに適したGal4とFLP系統の組み合わせを見出した。更に、この手法によって標識された投射神経を単離・回収し、total RNAの抽出、線形増幅を行った結果、投射神経の系譜依存的な遺伝子発現プロフェイルを得ることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PA-GFPによる投射神経標識は成功したものの本研究目的には適さないことが判明した。一方、Gal4/UAS法とFLP/FRT法を組み合わせることで、PA-GFPと同等レベルの解像度で、しかも簡便に投射神経を標識する手法を見出した。現在、この手法を用いて特異的な投射神経集団の遺伝子発現プロファイルを得ることに成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、当初の研究目的の達成に向けて順調に研究は進んでいる。今年度は、昨年修得した技術（標識法、細胞分散、回収、total RNA抽出法、増幅法）を更に改良し、遺伝子発現プロファイルのデータ信頼性を高める。更には、得られた遺伝子リストから、投射神経樹状突起ターゲティングに関わる可能性のある遺伝子の機能解析を開始する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初予定していたPA-GFPによる標識法から、Gal4/UAS, FLP/FRT法を用いた標識法に手法を変更したため、予算使用に時間的なズレが生じたため。
私が見出したGal4/UAS法とFLP/FRT法の組み合わせにより特定の投射神経が標識できるようになったため、本年度は効率的にRNA抽出、マイクロアレイ解析等を行うことができる。よって、これら研究に必要なマイクロアレイチップ、及びtotal RNAからの線形増幅に必要な試薬等を購入する必要がある。
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