研究課題
挑戦的萌芽研究
TALENを用いた特異的遺伝子ノックアウトについて, Golden GateシステムによるTALENベクターのコンストラクションをおこない，in vitro transcriptionによってmRNAを作成し，ショウジョウバエ初期胚に顕微注入する方法を検討した。その結果，3'非翻訳領域等を特別な配列に変更することなく，Exo84, CCHa2遺伝子など複数の遺伝子座について遺伝子ノックアウトに成功した。しかし，TALENペアによって機能するものと機能しないものとがあった。残念ながら，現在のところその違いの原因について不明である。しかし，機能するペアの場合にはノックアウトの効率は極めて高く，標的遺伝子座に対して複数のTALENペアを作成することで確実に遺伝子ノックアウトができるようになった。今後，さらに効率が良いとされるTALENシステム（プラチナTALEN等）を導入することにより，ゲノム上の任意の配列に対して標的にDNA切断を誘導する事ができる様になると期待される。一方，本研究計画申請後に急激に広まってきたCRISPR/Casについても，必要なベクターやハエ系統等を入手して検討を行った。現在までに，遺伝研よりCRISPR/Casシステムのショウジョウバエ系統及びプラスミドを分与して頂き（Kondo & Ueda 2013）検討した結果，ショウジョウバエでもCRISPR/Casシステム機能することを確認した。一包，海外のグループからは，sgRNA発現プラスミドのインジェクションによるより簡便なシステムが報告されており，こちらの実験系についても検討する必要があると思われた。
2: おおむね順調に進展している
H25年度は研究室の移転があったが，研究環境の立ち上げはスムーズに行うことができ，年度初頭より実験を開始することができた。TALENについて，複数の遺伝子座に対して標的遺伝子のノックアウトに成功し，CRISPR/Casについてもショウジョウバエで機能することを確認できた。今後の標的部位への遺伝子ノックインを検討するための準備は整ったと考えられる。このように，研究の進捗は概ね予定通りと考えられる。
TALENあるいはCRISPR/Casを用いて標的部位にDNA切断を入れ，その領域に外来DNAを相同組換えにより挿入する遺伝子ノックインについて手法の確立を目指す。第一段階としては，hsp70-mCherry-NLSや3xP6-mCherryカセットのノックインによって，標的遺伝子のnullアリルを効率良く選択する手法を検討する。さらに，第二段階としてGFPを翻訳コドンのフレームをあわせて挿入することや，GAL4を5'非翻訳領域への挿入を効率良く行うことができる手法の確立を目指したい。
すべて 2014 2013
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Development
巻: 141 ページ: 563-573
doi:10.1242/dev.097022
