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平成27年度はAtMAGOタンパク質の局在解析と、卵細胞および受精卵におけるRNAの局在解析を行った。AtMAGOタンパク質の局在解析に関しては、これまでにN末端側にGFPを融合させたGFP-AtMAGOタンパク質は機能を失うことが明らかとなっており、今年度はC末端にGFPを融合させたMAGO-GFPを作成し、atmago-1変異体に形質転換した。現在、atmago-1変異体背景でAtMAGO-GFPを発現する植物体を選抜中である。ヒトMAGO抗体を用いた免疫染色法では幾つかの固定法を試した。また、whole mountおよびsection免疫染色も行った。その結果、卵細胞の核においてシグナルが観察された。AtMAGO特異的なシグナルであるかを確認するため、現在atmago-1変異体における解析を行っている。
卵細胞および受精卵におけるRNAの局在解析においては、RNA結合タンパク質PUMを人為的に改変し目的のmRNAに結合させる系の構築を試みた。改変型PUMタンパク質と目的のmRNAを培養細胞に発現させたところ、特異的な結合が観察されなかった。現在、mRNAを可視化させる新しい技術Click-iTを採用し植物細胞特に卵細胞および受精卵のmRNAの標識化を試みている。Click-iT技術はウリジンのヌクレオチド類自体5-ethynyl uridineを活発なRNA合成の間にmRNAに取り込ませることによりmRNAを標識する。卵細胞および受精卵を含む胚珠に類自体を取り込ませる予備実験を行っており、植物細胞の卵細胞および受精卵においてmRNAを可視化する初めての系が構築されると期待している。これにより、mRNAの局在化におけるAtMAGOの機能解析が可能となるであろう。
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