| 研究課題/領域番号 |
25650113
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
深田 吉孝 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80165258)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 視覚 / 光受容 / 視細胞 / マイクロアレイ解析 / 転写制御 / 桿体 / 錐体 / ゼブラフィッシュ |
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| 研究概要 |
脊椎動物の視細胞には桿体と錐体の二種類が存在し、錐体は発現する光受容分子（オプシン）の種類によってさらに四種類のサブタイプに分類される。これらの錐体オプシンのうち緑オプシンと青オプシンの遺伝子は哺乳類では失われているため、それらの発現制御機構の解析は遅れ、謎に包まれていた。そこで申請者は、先行研究で独自に同定した７つの錐体特異的転写因子（未発表）に対して、各機能を欠損したゼブラフィッシュ系統をTALENを用いて作製した。これらの変異体における光受容分子の発現解析を行った結果、sixファミリーに属する転写因子six7の変異体において緑オプシンの発現がほぼ消失することを見出した。また、哺乳類においては桿体の成熟に関わることが知られている転写因子nr2e3の変異ゼブラフィッシュ系統を作製したところ、桿体特異的な遺伝子の発現が減少することを見出した。このnr2e3変異体は桿体の外節形成機構の解析に供する遺伝子の絞り込みに有用であると考えられた。
一方、視細胞の形態形成機構に迫るために桿体外節を可視化するツールとして、桿体光受容分子ロドプシンおよび桿体外節の円板膜構成因子であるペリフェリン2を選定し、それらと蛍光タンパク質との融合蛋白質を発現するレポーターコンストラクトを作製した。これと並行して、桿体特異的遺伝子あるいは桿体・錐体・松果体細胞という繊毛型光受容細胞に共通して強く発現する遺伝子のノックダウンコンストラクトを作成すると共に、そのN末端に標識タグを付加した強制発現コンストラクトの作製を進めた。現在、これらコンストラクトをマウス網膜に導入する電気穿孔法を試み、候補遺伝子の機能解析実験系を構築中である。また、全ての繊毛型光受容細胞に共通して強く発現する遺伝子群に着目し、その遺伝子変異ゼブラフィッシュ系統の作製に着手し、現在までに二つの遺伝子に対する変異系統を樹立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゼブラフィッシュを用いた錐体オプシンの発現制御機構の解析において予想以上の進展が見られ、緑オプシンの発現制御に関わる転写因子を同定することに成功した。また、視細胞の形態形成機構に関する解析については、必要なツールの調製を現在までに完了し、候補遺伝子の機能解析を精力的に進めているところである。繊毛型の光受容細胞に共通して強く発現する遺伝子の変異ゼブラフィッシュ系統も複数系統を樹立しており、交付申請書の実施計画に記載した内容を順調に達成することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に引き続き、視細胞の形態形成機構における候補遺伝子の機能解析を進める。視細胞の形態形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定に成功した場合には、交付申請書に記載した平成26年度の研究計画書に従って研究を遂行する。視覚生理機能の評価のためには、当初は計画していなかったCRISPR/Casシステムを用いた標的遺伝子のノックアウトマウスの作製も視野に入れる。また、標的遺伝子を錐体に異所発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を樹立する。一方、ゼブラフィッシュにおける緑オプシンの発現制御機構を明らかにするために、初年度に同定した転写因子six7の作用機序の解明を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
電気穿孔法によるマウス網膜への遺伝子導入実験を行うためのマウス購入費に多額の費用を計上していたが、ゼブラフィッシュ変異体を用いた解析において予想以上の進展が見られたために、結果としてマウス網膜への遺伝子導入実験の着手が遅れた。また、当初の予定と異なり、CRISPR/Casシステムを用いることによりノックアウトマウスの作製費用が安価になったために、今後の予定においてノックアウトマウスの作製を予定しており、その費用を捻出するために次年度に研究費を繰り越すことにした。
前年度までに視細胞の形態形成機構を解析するためのツール開発を終え、現在はマウス網膜への遺伝子導入実験を精力的に行っている。そのためのマウス購入費やプラスミドコンストラクトの作製に要する物品費に使用する。視細胞の形態形成機構に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定に成功した場合には、その後の視覚生理機能の評価のためにCRISPR/Casシステムを用いたKOマウスの作製を検討しており、その費用に使用する予定である。
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