| 研究課題/領域番号 |
25660052
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
有岡 学 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (20242159)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | マンナナーゼ / シロアリ共生原生生物 / ヘミセルロース |
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| 研究実績の概要 |
ヤマトシロアリReticulitermes speratusの後腸に共生する原生生物群からクローニングされた2種類のマンナナーゼ（RsMan26AおよびRsMan26B）はいずれも糖質加水分解酵素（Glycoside Hydrolase: GH）ファミリーのGH26に属している。本研究ではその機能解析を目的として、P. pastoris KM71H株を宿主とした異種生産を行った。生産に用いたプラスミドは、GAPプロモーター制御下でN末端にmycタグとHis6タグが付加された成熟体RsMan26X（X=AまたはB）が菌体外に分泌されるように構築されている。培養上清のマンナナーゼ活性を検討した結果、どちらも活性が認められた。精製酵素を用いて酵素学的性質を解析したところ、両酵素とも低pH（3.0～5.0）において高い活性を示した。マンノオリゴ糖との反応産物を薄層クロマトグラフィーにより解析したところ、RsMan26Aは6糖以上の鎖長のマンノオリゴ糖を、RsMan26Bは4糖以上の鎖長のマンノオリゴ糖を基質とすることが分かった。また、天然のマンナン基質である直鎖マンナン、Locust bean gum（LBG）、グルコマンナン、グアーガムとの反応性を比較したところ、RsMan26AはLBGに対して最も高い活性を示し、RsMan26Bはグルコマンナンに対して最も高い活性を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2つの新規マンナナーゼの発現と精製、および性質の検討に成功した。それぞれがお互いに、また従来取得されていたシロアリ共生原生生物由来のマンナナーゼとも異なる性質を持つことがわかり、ヘミセルロース分解に用いる酵素の選択肢を増やすことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き新規マンナナーゼの生産に取り組み、その性質をこれまで得られていた酵素群と比較検討する。また、GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼの生産も試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼの酵母Pichia pastorisを用いた生産において、分泌生産が認められなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
大腸菌での生産とリフォールディングを行う。平成27年4月から準備を始め、5月に発現プラスミドを作製し、大腸菌への形質転換を行う。6月以降、発現条件を検討し、発現に成功すれば、高圧法を用いたリフォールディングを行う。
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