| 研究課題/領域番号 |
25660138
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉山 淳司 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (40183842)
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| 研究分担者 |
堀川 祥生 京都大学, 生存圏研究所, 研究員 (90637711)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 近赤外スペクトロスコピー / 糖化 / エンドグルカナーゼ活性 / 重合度 / 多変量解析 |
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| 研究概要 |
バイオマス試料としてユーカリ(Eucalyptus globulus)を採用し、Wise法ならびに5% (w/w)水酸化ナトリウム処理によってマトリックス成分を除去した。得られた基質をグラインダーで解繊処理することにより分散性の高いセルロースIを調製し、これを標準基質とした。評価する酵素はTrichoderma reesei由来のEG(エンドグルカナーゼ)およびCBH(セロビオハイドロラーゼ)、Novozyme社から購入したBGL(β-グルコシダーゼ)、市販セルラーゼ製剤(Accellerase 1500, Genencor社)を対象とした。
重合度測定に関しては、まず洗浄した糖化残渣を凍結乾燥し、五酸化二リン共存下で真空乾燥を行った。次に、ピリジン溶媒中、フェニルイソシアネートと反応させて、セルローストリカルバニレートへ誘導体化した。得られた試料をTHF(テトラヒドロフラン)に溶解させ、GPC(ゲル浸透クロマトグラフィ、Shodex社)分析することで、セルロース誘導体の平均分子量（ポリスチレンスタンダード換算）を決定した。
CMC(カルボキシメチルセルロース)といったモデル基質による酵素評価法では、TrEGIとTrEGIIの分解活性はほぼ同じ値を示したが、本年度に開発した重合度による評価法から得られたエンドグルクナーゼ活性はTrEGIよりもTrEGIIの方が明らかに高かった。これは前処理バイオマスの評価とも一致する結果であった。次年度、セルロース重合度をより迅速に、また再現性よく進めるために、近赤外法を用いたハイスループット解析法を開発する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
目標にあげた、（１）実験に用いたセルロースの標準化（２）トリコデルマ分解系のなかで重要なエンドグルカナーゼの活性評価（３）GPC解析による重合度の測定、について予定通り実験を進めることができ、成果を学会にて発表した。ただし、トリコデルマ系のCBHに関する実験のみ、次年度に他の菌株由来の酵素と合わせて実験することに予定変更した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度は、トリコデルマ系エンドグルカナーゼのみを対象酵素としたが、次年度はトリコデルマ系のCBHに加えて、他の菌株が生産する有用酵素（エンドグルカナーゼ、CBH酵素など）について同様の解析を行う。また、GPCによる分子量測定は時間と労力を要するので、近赤外スペクトルなどを用いたハイスループット法の開発を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ハイスループット解析には、Unscramblerの新バージョンのもつ機能が役立つと考え、購入を計画していたが、初年度は現バージョンのUNscramblerによる検討段階でとどまるに至ったため、次年度に購入を延期することとした。トリコデルマ系、CBH酵素に関する実験を開始する予定であったが、十分量酵素を取得できなかったため見送ることとした。
Unscramblerの新バージョンへの更新を行う。トリコデルマ系のCBH酵素に関する実験を、他の菌株由来の酵素と同時に実施する。
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