| 研究課題/領域番号 |
25660259
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
細井 美彦 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (70192739)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 半数体ES細胞 / テラトーマ / 胚様体 |
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| 研究概要 |
特定の遺伝子を欠損させたノックアウト動物は、その表現系の解析から新規疾患関連遺伝子等の発見が可能となるとともに、病態モデルを同技術で作製することで、新規創薬研究や疾患のメカニズムの解明に有効なツールとなる。しかしながら、現在までの研究において、多くのノックアウト動物は、マウスやラットなどのげっ歯類が主流となっており、ヒトへの外挿や家畜への応用を考慮した場合、ウサギやサル、ウシなどより大型の動物種においてノックアウト動物を作製し、モデルを構築する必要が有る。そこで、本研究では、現行のノックアウト動物作製技術の改善のため、半数体ウサギ胚性幹細胞の樹立を行い、従来の作製法と異なった新規のキメラ個体作製法の開発を目指す。
本年度は、半数体ES細胞の樹立が安定的に行える技術を確立するために、まずはよく研究がなされているマウスをモデルに、雌性半数体単為発生胚及び半数体ES細胞の樹立を試みた。本実験で実施した方法は、まずマウス未受精卵にストロンチウム処理をすることで単為発生に必要な活性化を行う。通常、2倍体の単為発生を作製する場合、サイトカラシンBで同時に処理することで減数分裂を抑制するが、本研究では半数体単為発生胚の作製が必要なため、サイトカラシンB処理を行なわず、胚盤胞期胚まで発生した胚を準備した。得られた胚から既存のES細胞の樹立技術を適用することで半数体ES細胞の樹立を試みたところ2株のES細胞株が得られた。これらの細胞株は、核型解析から半数体細胞であることが示され、また、遺伝子発現パターンなどから未分化性の有無、及びテラトーマ作製能や胚様体誘導能から多能性の有無についても既存のES細胞と同等の能力を有していることが明らかとなった。特に、従来のES細胞株樹立技術の適用が可能であったことから、ウサギにおいても半数体ES細胞の樹立が可能であると示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではウサギ半数体胚由来胚盤胞期胚からES細胞を樹立し、半数体ES細胞を由来とした遺伝子改変動物の作製を目的としている。
本年度では、これらの研究を進める上で最も重要な「半数体胚の作製とES細胞の樹立方法の確立」を実施するため、まずマウス未受精卵から半数体雌性単為発生胚の作製及びES細胞の樹立を実施した。得られた細胞はES細胞としての大きな特徴である未分化性と多能性を有していることから実験モデルとしての半数体胚の作製及びES細胞の樹立技術の確立を行った。また、興味深いことに、半数体ES細胞は通常の2倍体ES細胞と大きな性質の差がなく、これまでに確立されている培養技術を適用することで、作出が可能であることがわかった。しかしながら、半数体胚の作製効率の低さや半数体ES細胞としての維持の難しさから、これらの改善が必要であると考えられる。また、いくつかの未分化維持機構の活性化によって半数体ES細胞の維持が容易になることが培養条件の検討から明らかとなり、多能性幹細胞における恒常性の維持においても非常に興味深い知見が得られた。このように、本年度で実施した研究の達成度はおおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究から、マウス雌性半数体単為発生胚から未分化性及び多能性を有するES細胞の樹立する実験系を確立することができた。また、我々は雌性だけでなく雄性半数体単為発生胚を由来としたES細胞の樹立も計画している。したがって次年度では、除核したマウス受精卵に精子をひとつ注入し、活性化処理によって得られた雄性半数体胚盤胞期胚を由来とするES細胞の樹立を試みる。
次にウサギを材料とし、前年度で確立した技術と当研究室で確立したウサギES細胞樹立方法を用いて、雌性半数体単為発生胚及びES細胞の作出を試みる。また、同時に雄性半数体単為発生胚及びES細胞の作出も試みる。得られた細胞株は、未分化関連遺伝子の発現や三胚葉系列への多分化能を有しているか評価を行い、野生型ウサギES細胞との比較をおこなうことで、ウサギ半数体ES細胞がES細胞としての性質を維持したまま培養が可能であるかを明らかにするために研究を実施する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度は、マウスを材料とした雌性半数体胚のES細胞の樹立と培養に必要な培養液・成長因子の決定に関する研究が順調に進んだ。比較のため、マウス雄性半数体胚及びES細胞の樹立と培養に必要な実験も比較のため必要となったが、次年度に持ち越した。また、マウスのデータを基に、ウサギES細胞とマウスES細胞はいくつか培養条件が異なることが知られているので、次年度、比較を試みる予定で、予備実験を行う予定であったが、ウサギ半数体胚及びES細胞の樹立に関する研究が予定より遅れたため、得られた細胞株の解析や分化能の検定などを行なう試薬や実験動物の購入が少なかった。
次年度では、引き続きマウスを材料とし、雄性半数体胚及びES細胞の樹立と培養に必要な培養液・成長因子を購入する予定である。ウサギES細胞とマウスES細胞はいくつか培養条件が異なることが知られている。次年度はウサギを材料とし、ウサギ半数体胚及びES細胞の樹立に関する研究を進めるため、ウサギ胚及びES細胞の培養に必要な培養液・成長因子を購入する予定である。また、得られた細胞株の解析として、2倍体ES細胞との遺伝子発現パターンの違いや分化能の検定などを行なう。これらの解析には主に、Westernblot、Realtime-PCR、免疫染色、テラトーマ作製などを実施する予定であるため、これらに関係する試薬や実験動物の購入を行う。
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