非天然型アミノ酸を有する新規機能性抗体の安定的生産システムの開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25670023
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 樋野 展正 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (90469916)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 非天然型アミノ酸 / 非天然アミノ酸 / 拡張遺伝暗号 / tRNA / 抗体薬物複合体 / 部位特異的修飾

研究実績の概要

非天然型アミノ酸を部位特異的に導入した抗体分子を安定的に生産する培養細胞株を樹立するには，導入部位を規定するUAGコドンに結合する非宿主tRNAとそのtRNAに特異的に非天然型アミノ酸を付加するアミノアシルtRNA合成酵素を恒常的に発現する細胞株の取得が必須である．本年度は，非宿主tRNAを哺乳類細胞内で効率良く転写・成熟させる仕組みの構築を行った．まず，前年度に引き続き，非宿主tRNA遺伝子を哺乳類tRNA遺伝子と同じく核小体で転写させることを狙った核小体局在化ベクターを構築した．周辺配列を核小体に局在させるという報告がある5SrRNA遺伝子配列を非宿主tRNA遺伝子配列近傍にタンデムに４個並べたベクターを構築し，293 c18細胞に導入した際のtRNAの発現量を測定したところ，前年度に構築した5SrRNA遺伝子配列を１個配置したベクターを用いた場合と比べてtRNA発現量の向上は見られなかった．このことから，5SrRNA遺伝子配列を並列することによるtRNA発現量の増加は限定的であることがわかった．
次に，より生理的なtRNA遺伝子の転写環境を再現するため，宿主tRNA遺伝子が存在するゲノム領域に非宿主tRNA遺伝子を挿入することを考えた．この前段階として，非宿主tRNA遺伝子の前後に宿主tRNA遺伝子のゲノム周辺配列を約1Kbpずつ配置したベクターを構築し，周辺配列がtRNA遺伝子の転写に及ぼす影響を調べた．このベクターをCHO細胞内に導入した際のtRNAの発現量を測定したところ，周辺配列を持たないベクターを用いた場合に比べてtRNAの発現量が2倍程度に向上することがわかった．この結果は，非宿主tRNAの安定発現細胞株を樹立する上でのその遺伝子の挿入部位として，宿主tRNAが存在するゲノム領域が有力な候補のひとつであることを示している．

研究成果

• [雑誌論文] Endothelial cell-specific expression of roundabout 4 is regulated by differential DNA methylation of the proximal promoter (2014)
  • 著者名/発表者名: Okada, Y., Funahashi, N., Tanaka, T., Nishiyama, Y., Yuan, L., Shirakura, K., Turjman, A. S., Kano, Y., Naruse, H., Suzuki, A., Sakai, M., Zhixia, J., Kitajima, K., Ishimoto, K., Hino, N., Kondoh, M., Mukai, Y., Nakagawa, S., Garcia-Cardena, G., Aird, W. C., Doi, T.
  • 雑誌名: Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 巻: 34 ページ: 1531-1538
  • DOI: 10.1161/ATVBAHA.114.303818.
  • 査読あり
• [学会発表] タンパク質間の相互作用部位の解析を可能にする細胞内光クロスリンク技術の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 一瓢奨
  • 学会等名: 第13回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2014
  • 発表場所: 富山
  • 年月日: 2014-09-20 – 2014-09-21
• [学会発表] 非天然型アミノ酸含有タンパク質の安定生産系の構築 (2014)
  • 著者名/発表者名: 喜多絢海、一瓢奨、樋野展正、土井健史
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第９回年会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-06-11 – 2014-06-13
• [学会発表] プローブ転移能を有する光クロスリンカーを用いた細胞内タンパク質間相互作用解析法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 一瓢奨、喜多絢海、張功幸、高島成二、樋野展正、土井健史
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第９回年会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-06-11 – 2014-06-13
• [備考]
  • URL: http://www.phs.osaka-u.ac.jp/homepage/b018/index.html