人工ヌクレアーゼを用いた早老症ｉＰＳ細胞の遺伝子修正と治療への応用

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25670030
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 嶋本 顕 広島大学, 大学院医歯薬保健学研究院, 准教授 (70432713)
• 研究分担者: 河合 秀彦 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教 (30379846)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ウェルナー症候群 / iPS細胞 / 人工ヌクレアーゼ / ゲノム編集 / 遺伝子修正

研究実績の概要

ウェルナー症候群(WS)は，テロメア機能不全による体細胞の早期老化が全身性に加齢を促進して，皮膚潰瘍，糖尿病，動脈硬化、がんなどを早期に発症する早老症である。本研究では，患者iPS細胞の変異遺伝子を人工ヌクレアーゼにより修正し，正常で拒絶のない患者iPS細胞を樹立することを目的とする。
本年度はまず、患者iPS細胞が有するWRN遺伝子変異Mut-4 (c.3139-1G>C)の領域を含むエクソン25～27をカバーする正常WRN遺伝子を、健常者ゲノムDNAを鋳型として増幅し、この領域を組み込んだターゲティングベクターを構築した。そして、前年度に構築したWRN遺伝子標的TALEヌクレアーゼとともにiPS細胞に導入し、ターゲティングベクターのイントロン部分に組み込まれたpuromycin耐性遺伝子をマーカーとして、puromycin耐性のiPS細胞クローンを選択培養により多数樹立した。ターゲティングベクターでカバーされたWRN遺伝子領域のより上流及びより下流のプライマーと、puromycin耐性遺伝子にデザインされたプライマーを組み合わせて、PCRによりターゲティングベクターがiPS細胞の染色体におけるWRN遺伝子標的部位と置き換わっているクローンを選択し、さらにシーケンシングによりMut-4が正常に修正されているクローンを同定した。
今後の検討課題として、WSのQOL低下の原因の一つである皮膚潰瘍を対象とした、間葉系幹細胞を用いた治療を想定し、患者iPS細胞及び変異が修正されたiPS細胞から誘導した間葉系幹細胞の性状を比較して、変異が修復されたiPS細胞由来間葉系幹細胞では早期老化の表現形が抑制されていることを証明するとともに、皮膚潰瘍モデルマウスへの移植実験を通じて、間葉系幹細胞を用いた皮膚潰瘍治療のPOCを確立したい。

研究成果

• [雑誌論文] Werner Syndrome-specific induced pluripotent stem cells: recovery of telomere function by reprogramming. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shimamoto A, Yokote K, Tahara H
  • 雑誌名: Frontiers in Genetics 巻: 6 ページ: 10
  • DOI: 10.3389/fgene.2015.00010
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 細胞老化研究の新展開 (2015)
  • 著者名/発表者名: 嶋本 顕、田原栄俊
  • 雑誌名: 基礎老化研究 巻: 39 ページ: 3-11
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reprogramming Suppresses Premature Senescence Phenotypes of Werner Syndrome Cells and Maintains Chromosomal Stability over Long-Term Culture. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimamoto A, Kagawa H, Zensho K, Sera Y, Kazuki Y, Osaki M, Oshimura M, Ishigaki Y, Hamasaki K, Kodama Y, Yuasa S, Fukuda K, Hirashima K, Seimiya H, Koyama H, Shimizu T, Takemoto M, Yokote K, Goto M, Tahara H
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e112900
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0112900
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TERT attenuated ER stress-induced cell death. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosoi T, Inoue Y, Nakatsu K, Matsushima N, Kiyose N, Shimamoto A, Tahara H, Ozawa K
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 447 ページ: 378-382
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.04.034
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Telomeric g-tail length and hospitalization for cardiovascular events in hemodialysis patients. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirashio S, Nakashima A, Doi S, Anno K, Aoki E, Shimamoto A, Yorioka N, Kohno N, Masaki T, Tahara H
  • 雑誌名: Clin J Am Soc Nephrol 巻: 9 ページ: 2117-2122
  • DOI: 10.2215/CJN.10010913
  • 査読あり
• [学会発表] 遺伝子発現プロファイルから見た細胞の老化と若返り (2015)
  • 著者名/発表者名: 嶋本 顕，田原栄俊
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸学院大学
  • 年月日: 2015-03-25 – 2015-03-28
  • 招待講演
• [学会発表] Progeroid syndrome as a model of aging-related metabolic disorders (2014)
  • 著者名/発表者名: Koutaro Yokote, Takahiko Shimizu, Akira Shimamoto, Minoru Takemoto
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
  • 招待講演
• [学会発表] リプログラミングはウェルナー症候群細胞の早期老化を抑制する (2014)
  • 著者名/発表者名: 嶋本 顕，田原栄俊
  • 学会等名: 第73回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27