植物に作らせた可食性ＩｇＡ抗体による腸管粘膜表面での生体防御免疫の研究

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25670063
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 今井 康之 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (80160034)
• 研究分担者: 黒羽子 孝太 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (90333525)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 粘膜免疫 / 抗体医薬 / 免疫グロブリンA / 植物発現系 / 生体防御効果

研究実績の概要

母乳には免疫グロブリンA (IgA)が分泌され、乳児の腸管粘膜からの病原体や毒素の侵入を粘膜表面で阻止している。抗体医薬や高次機能性食品としての利用を展望し、経口投与できる分泌型IgAの有用性を研究するため、ベロ毒素(Stx1)に対する組換え型IgAを発現する植物を作製した。IgA抗体のH鎖、L鎖、J鎖および分泌片を一つのバイナリーベクターに組み込み、アグロバクテリウム法にてモデル植物シロイヌナズナおよび実用植物リーフレタスにて分泌型IgAの発現に成功した。シロイヌナズナに発現させた植物抗体は、Vero細胞のStx1による細胞傷害を試験管内で中和した。
植物抗体による毒素中和活性を生体内で調べるため、マウス肛門よりStx1を投与し、大腸上皮細胞の傷害を検討した。昨年度までの検討によりTUNEL法によっては上皮細胞の傷害が十分に示されなかったが、今回活性型caspase-3の免疫組織染色によって、アポトーシス誘導の初期過程を観測できた。これにより、in vivoで毒素中和活性を評価する一つの手段が得られた。
一方、経口投与したIgAが、大腸に届くのかどうかを評価するため、Stx1のBサブユニット(Stx1B)に特異的マウスモノクローナル抗体G2G7（2量体IgA）を経口投与して、糞中から活性のあるIgAの検出を試みた、その結果、確かに固相化Stx1Bに結合活性のあるIgAがELISAで検出された。G2G7は毒素中和活性がないため、中和活性のある分泌型植物抗体を用いて今後検討を進める予定である。
植物での発現部位については、葉の超薄切片を用いた観察から、トランスジェニック植物において特異的に細胞質内にプロテインボディーを見出した。金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡法によって、プロテインボディー内にIgAのH鎖および分泌片の存在を明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] Recombinant IgA specific for influenza A virus hemagglutinin: production, functional analysis and formation of secretory IgA. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kentaro Shoji, Tadanobu Takahashi, Kohta Kurohane, Koki Iwata, Takeshi Matsuoka, Shogo Tsuruta, Takatomo Sugino, Masaki Miyake, Takashi Suzuki, Yasuyuki Imai
  • 雑誌名: Viral Immunol. 巻: 28, ページ: 170-178
  • DOI: 10.1089/vim.2014.0098
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Stable expression and characterization of monomeric and dimeric recombinant hybrid-IgG/IgA immunoglobulins specific for Shiga toxin. (2014)
  • 著者名/発表者名: Koki Iwata, Kohta Kurohane, Katsuhiro Nakanishi, Masaki Miyake, Yasuyuki Imai
  • 雑誌名: Biol. Pharm. Bull. 巻: 37 ページ: 1510-1515
  • DOI: 10.1248/bpb.b14-00323
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Shiga toxin-induced apoptosis is more efficiently inhibited by dimeric recombinant hybrid-IgG/IgA immunoglobulins than by the parental IgG monoclonal antibodies. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kohta Kurohane, Kyoko Nagano, Katsuhiro Nakanishi, Koki Iwata, Masaki Miyake, Yasuyuki Imai
  • 雑誌名: Virulence 巻: 5 ページ: 819-824
  • DOI: 10.4161/21505594.2014.973804
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Plantibodyの臨床応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中西勝宏、黒羽子孝太、今井康之
  • 雑誌名: 臨床免疫・アレルギー科 巻: 62 ページ: 192-197
• [学会発表] Separation and characterization of intact dimeric form of Shiga toxin 1-specific hybrid-IgA plantibodies expressed in Arabidopsis thaliana. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shogo Tsuruta, Katsuhiro Nakanishi, Kohta Kurohane, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: 第43回日本免疫学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都市
  • 年月日: 2014-12-10 – 2014-12-12
• [学会発表] In vitro formation of a secretory hybrid IgA specific for influenza A virus hemmagglutinin. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Matsuoka, Kohta Kurohane, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: 第43回日本免疫学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都市
  • 年月日: 2014-12-10 – 2014-12-12
• [学会発表] Development of Shiga toxin-specific hybrid IgA-tag: focus on the purification process. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Matsuoka, Kohta Kurohane, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: Sixth Annual Protein & Antibody engineering Summit
  • 発表場所: Lisbon, Portugal
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-07
• [学会発表] Comparison of the hybrid IgA expressed in plant and mammalian cell systems. (2014)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Nakanishi, Shogo Tsuruta, Kohta Kurohane, Yasuo Niwa, Hirokazu Kobayashi, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: Sixth Annual Protein & Antibody engineering Summit
  • 発表場所: Lisbon, Portugal
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-07
• [学会発表] Purification of dimeric hybrid-IgA expressed in plants and mammalian cells using thiophilic adsorption chromatography. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shogo Tsuruta, Katsuhiro Nakanishi, Kohta Kurohane, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: The 2nd International Conference on Pharma and Food
  • 発表場所: 日本平ホテル、静岡市
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-06
• [学会発表] Development of neutralizing hybrid-IgG/IgA specific for Shiga toxin. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kohta Kurohane, Katsuhiro Nakanishi, Yasuyuki Imai
  • 学会等名: 11th Japan-China International Symposium on Health Sciences
  • 発表場所: 静岡県立大学、静岡市
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-05
  • 招待講演
• [備考] 免疫微生物学教室のホームページ
  • URL: http://w3pharm.u-shizuoka-ken.ac.jp/bisei/
• [備考] 免疫微生物学教室のホームページ（英語）
  • URL: http://w3pharm.u-shizuoka-ken.ac.jp/bisei/English/index.html