ヒト多能性幹細胞Muse細胞からの精子細胞系樹立の試み

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670087
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 年森 清隆 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20094097)
• 研究分担者: 伊藤 千鶴 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80347054)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: Muse細胞 / 精子幹細胞 / ストレス処理

研究概要

1.Muse幹細胞から精子幹細胞系へ誘導するために必要な遺伝子/分子と因子を絞り込み、Muse幹細胞を含むMuse-GFP細胞の長期培養系の準備を進めた。
2.W/Wvミュータントマウスの精巣（セルトリ細胞only）精細管内への移植は問題ないが、導入細胞の前処理が必要であるため、その条件を検討した。レポーター遺伝子Acrosin-GFPマウスの脾臓細胞を採取し、さまざまのストレスのなかから酸処理をして精細管内への注入実験を行った結果、まだ良い結果は得られていないが、長期生存しているマウスについてもう少し時期を延ばしてから開腹し蛍光観察する。これらの条件検討を踏まえて、次年度にMuse-GFP細胞のインジェクションを増やす。酸処理意外に様々なストレス処理が有効である可能性があるため、ヒト化細胞やマウス細胞＋ストレス処理＋誘導処理（例えば、FGFやLIF）を行い、うまく発現する系を選別する。
3.遺伝子導入が必要な場合のためにMuse-GFP細胞に導入するためのトランスフェクション準備を整えた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Muse幹細胞から精子幹細胞への誘導についてはこれまで報告がないため、手探りの状態である。Muse幹細胞の最適の前処理と最適の関連分子や遺伝子の組合わせを見つけ出すことが困難である。分化した細胞からさまざまの処理により初期化に向かい、精子幹細胞系へ向かう最適条件を探すことが難しい。

今後の研究の推進方策

様々な前処理をすることには問題無いため、頻回に実験を行うためのMuse-GFP細胞長期培養系を確立する。大きな問題は、Muse幹細胞の含有率であるが、1回のinjectionで10000個程度を注入できれば、たとえその中に1％以下の濃度であったとしても、これまでの実験から精細管内では定着できる可能性がある。最適のヒト化細胞やマウス細胞＋ストレス処理＋誘導処理（例えば、FGFやLIF）を行う条件を見いだすための実験を行う。移植実験手技や解析方法には全く問題はない。

研究成果

• [雑誌論文] A heterozygous mutation of GALNTL5 affects male infertility with impairment of sperm motility. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takasaki N, Tachibana K, Ogasawara S, Matsuzaki H, Hagiuda J, Ishikawa H, Mochida K, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Noce T, Ito C, Toshimori K, Narimatsu H
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA. 巻: 111 ページ: 1120-1125
  • DOI: 10.1073/pnas.1310777111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oligo-astheno-teratozoospermia in mice lacking ORP4, a sterol-binding protein in the OSBP-related family. (2014)
  • 著者名/発表者名: Udagawa O, Ito C, Ogonuki N, Sato H, Lee S, Tripvanuntakul P, Ichi I, Uchida Y, Nishimura T, Murakami M, Ogura A, Inoue T, Toshimori K, Araki H.
  • 雑誌名: Genes Cells. 巻: 19(1) ページ: 13-27
  • DOI: 10.1111/gtc.12105
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Arf GAP SMAP2 is Necessary for Organized Vesicle Budding from the Trans-Golgi-network and Subsequent Acrosome Formation in Spermiogenesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Funaki T, Kon S, Tanabe K, Natsume W, Sato S, Shimizu T, Yoshida N, Wong WF, Ogura A, Ogawa T, Inoue K, Ogonuki N, Miki H, Mochida K, Endoh K, Yomogida K, Fukumoto M, Horai R, Iwakura Y, Ito C, Toshimori K, Watanabe T, Satake M.
  • 雑誌名: Mol Biol Cell. 巻: 24(17) ページ: 2633-2644
  • DOI: 10.1091/mbc.E13-05-0234
  • 査読あり
• [雑誌論文] Integration of the mouse sperm fertilization-related protein equatorin into the acrosome during spermatogenesis as revealed by super-resolution and immunoelectoron microscopy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ito C, Yamatoya K, Yoshida K, Fujimura L, Hatano M, Miyado K, Toshimori K.
  • 雑誌名: Cell Tissue Res. 巻: 352(3) ページ: 739-750
  • DOI: 10.1007/s00441-013-1650-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tysnd1 deficiency in mice interferes with the peroxisomal location of PTS2 enzymes, causing lipid metabolic abnormalities and male infertility. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mizuno Y, Ninomiya y, Nakachi Y, Iseki M, Iwasa H, Akita M, Tsukui T, Shimozawa N, Ito C, Toshimori K, Nishimura M, Hara H, Maeba R, Okazaki T, Alodaib AN, Amoudi MA, Jacob M, Alkuraya FS, Horai Y, Watanabe M, Motegi H, Wakana S, Noda T, Kurochkin IV, Mizuno Y, Schonbach C, Okazaki Y.
  • 雑誌名: PLoS genet 巻: 9(2) ページ: e1003286
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003286
  • 査読あり
• [雑誌論文] Galnt3 deficiency disrupts acrosome formation and leads to oligoasthenoteratozoospermia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyazaki T, Mori M, Yoshida CA, Ito C, Yamatoya K, Moriishi T, Kawai Y, Komori H, Kawane T, Izumi S, Toshimori K, Komori T.
  • 雑誌名: Histochem and Cell Biol 巻: 139(2) ページ: 339-354
  • DOI: 10.1007/s00418-012-1031-3
  • 査読あり
• [学会発表] 雄生殖細胞の機能形態的解析；精子卵子膜融合関連タンパク質 Equatorinを中心として (2014)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 自治医科大学キャンバス
  • 年月日: 20140328-20140328
  • 招待講演
• [学会発表] 精子先体赤道部糖タンパク質 equatorin の糖鎖修飾変化に関わる酵素の探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大和屋健二
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 自治医科大学キャンバス
  • 年月日: 20140328-20140328
• [学会発表] マウス精子における膜タンパク質ベイシジン分子の特性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 前川眞見子
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 自治医科大学キャンバス
  • 年月日: 20140328-20140328
• [学会発表] モノクローナル抗体MC101が認識する精子タンパク質の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 陳城
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 自治医科大学キャンバス
  • 年月日: 20140328-20140328
• [学会発表] トランスジェニックマウスを用いた精子ODF2 の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤千鶴
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 自治医科大学キャンバス
  • 年月日: 20140327-20140327
• [学会発表] 受精障害の原因と検出 (2014)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 第19回日本臨床エンブリオロジスト学会 ワークショップ・学術講演会
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター
  • 年月日: 20140112-20140112
  • 招待講演
• [学会発表] Equatorinノックアウト雄マウスの受精現象 (2014)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 新学術領域研究 動植物に共通するアロ認証機構の解明 第8回領域会議
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス 野依記念学術交流会館
  • 年月日: 20140110-20140110
  • 招待講演
• [学会発表] 精子先体赤道部糖タンパク質 equatorin の分子量低下に関わる酵素の探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大和屋健二
  • 学会等名: 新学術領域研究 動植物に共通するアロ認証機構の解明 第8回領域会議
  • 発表場所: 古屋大学東山キャンパス 野依記念学術交流会館
  • 年月日: 20140109-20140109
• [学会発表] 精子の核DNA断片化と頭部空胞を指標にした精子の質の評価 (2013)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 第58回日本生殖医学会 学術講演会・総会
  • 発表場所: 神戸国際会議場 神戸ポートピアホテル
  • 年月日: 20131115-20131116
• [学会発表] 抗equatorin抗体を用いた精子の質の評価法の検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤千鶴
  • 学会等名: 第58回日本生殖医学会 学術講演会・総会
  • 発表場所: 神戸国際会議場 神戸ポートピアホテル
  • 年月日: 20131115-20131116
• [学会発表] 精子先体赤道部タンパク質Equatorinの先体反応に伴う翻訳後修飾変化 (2013)
  • 著者名/発表者名: 大和屋健二
  • 学会等名: 第58回日本生殖医学会 学術講演会・総会
  • 発表場所: 神戸国際会議場 神戸ポートピアホテル
  • 年月日: 20131115-20131116
• [学会発表] Visualization of spermatogenesis and sperm function. (2013)
  • 著者名/発表者名: Toshimori K
  • 学会等名: XXIII International Symposium on Morphological Sciences (ISMS)
  • 発表場所: Toki Messe Niigata Convention Center
  • 年月日: 20130911-20130911
  • 招待講演
• [学会発表] マウス精巣および精子における basigin およびその結合分子の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 前川眞見子
  • 学会等名: 日本アンドロロジー学会第32回学術大会ならびに総会 および第19回精子形成・精巣毒性研究会共同開催学会
  • 発表場所: グランキューブ大阪
  • 年月日: 20130726-20130726
• [学会発表] 新しい検査法に基づく精子の機能診断法および選別保存法の開発と生殖医療応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 公益財団法人双葉電子記念財団 自然科学研究助成成果発表会および研究助成・奨学金贈呈式
  • 発表場所: ホテルスプリングス幕張
  • 年月日: 20130705-20130705
  • 招待講演
• [学会発表] 精子の老化について (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤千鶴
  • 学会等名: 第13回日本抗加齢医学会総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130628-20130628
  • 招待講演
• [学会発表] 精子膜に起こる配偶子認識と融合に関する超微形態および分子レベルの解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: 新学術領域研究 動植物に共通するアロ認証機構の解明 第7回領域会議
  • 発表場所: くにびきメッセ
  • 年月日: 20130602-20130602
  • 招待講演
• [学会発表] 高解像顕微鏡およびSTEDを用いた受精関連タンパク質Equatorinの解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤千鶴
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第69回学術講演会
  • 発表場所: ホテル阪急エキスポパーク
  • 年月日: 20130520-20130523
• [学会発表] 新しい検査法に基づく精子の機能診断法および選別保存法の開発と生殖医療応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 年森清隆
  • 学会等名: なのはなコンペ2013表彰式 および なのはなコンペ昨年度受賞者成果発表会
  • 発表場所: 千葉大学けやき会館
  • 年月日: 20130423-20130423
  • 招待講演
• [図書] Equatorin-Related Subcellular and Molecular Events During Sperm Priming for Fertilization in Mice. (Chapter 7) (2014)
  • 著者名/発表者名: Ito C, Yamatoya K, Toshimori K.
  • 総ページ数: 480
  • 出版者: Springer
• [備考] 生殖生物医学ＨＰ
  • URL: http://www.m.chiba-u.ac.jp/class/devbiol/