研究課題
挑戦的萌芽研究
私達は、ニューロンに於けるリソソームの局在には極性があること、選択的オートファジーに関わるp62/NBR1にも極性があることを、リソソームカテプシンD(CD)欠損マウス脳のニューロンと初代培養大脳皮質神経細胞を用いて検討した。(1)p62/NBR1、GROD(CD欠損ニューロンに見られるリソソームで、セロイドリポフスチンを蓄える)のin vivoにおける局在化に関する解析:CD欠損マウス脳のニューロンはLC3、ユビキチン、p62とNBR1陽性であることから、凍結免疫電顕法を用いて免疫染色を行い、ユビキチン、p62、NBR1は同一のGRODの膜に局在することが分かった。さらに、光学顕微鏡レベルでp62/NBR1の局在を見ると脳梁や白質の軸索やその終末部には局在しないこと、電顕観察でもGRODは軸索領域には入り込まないことも分かった。(2)初代培養神経細胞を用いたp62/Nbr1局在解析:p62/NBR1の局在を解析するため、E16,17の初代培養大脳皮質ニューロンを用いた。内在性およびp62-GFP,NBR1-GFPともにAnkylin G陽性の軸索初節を超えて、軸索に侵入することはなかった。この局在の分子特性を検討した結果、これらの分子同士が結合するPB1ドメインを欠損し変異p62やcoiled-coilドメインを欠損した変異NBR1は、これらはAnkGを超えて軸索に侵入することが分かった。(3)CD/p62,CD/NBR1,CD/p62/NBR1を欠損するマウスを作成し、大脳皮質V層のニューロン、海馬錐体細胞、小脳プルキンエ細胞でオートファゴソームに取り込まれるGRODの両を計測した。その結果、トリプル欠損マウス脳ではGRODを含むオートファゴソームはほとんど見られないことが分かった。
1: 当初の計画以上に進展している
ほぼ予定通り、解析が進み、上記結果をまとめて論文を作成中である。
リソソームは、初代培養皮質ニューロンの培養7日目をすぎると軸索にはほとんど局在が見られなくなる。この局在の分子機構を解析する。現在、リソソーム膜タンパク質の細胞質側のドメインをGFPと結合したキメラタンパク質を作成し、この局在について検討を進めている。
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