肺がん転移に関与するシアリルルイス抗原キャリアータンパク質の同定と診断法の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25670166
• 研究機関: 高知大学
• 研究代表者: 本家 孝一 高知大学, 教育研究部医療学系, 教授 (80190263)
• 研究分担者: 姜 松林 高知大学, 医歯学系, その他 (80598540) [辞退]
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 糖鎖 / シアリルルイスX / スルホルイスX / 肺腺がん / 血行性転移

研究実績の概要

シアリルルイスX抗原はがんの血行性転移に関与する。ヒト肺腺がん細胞には分子量250kDa以上と分子量190kDaの二つのシアリルルイスX抗原キャリアータンパクが存在する。これらを同定するため、大量培養したヒト肺腺がん細胞ABC-1から、WGAレクチンクロマト、抗シアリルルイスX抗体を固相化したイムノアフィニティークロマト、MonoQイオン交換くクロマトを組み合わせて精製した。
精製タンパクをSDS-PAGEにかけ、分子量250kDa以上と190kDaの部位を別個に切り出し、トリプシンでゲル内消化を行った後、抽出したペプチド断片を質量分析装置にかけシアリルルイスX抗原キャリアータンパクXとYを同定した。Gal3ST-2導入細胞の膜タンパク抽出液を、同定したタンパクXとＹに対する抗体を用いて吸収実験を行い、分子量250kDaと分子量170kDaのスルホルイスX抗原キャリアータンパクが親細胞ABC-1のシアリルルイスX抗原キャリアータンパクX、Yとそれぞれ同じタンパクであることを確認した。
siRNAを用いてABC-1細胞における190kDaタンパクYの発現をノックダウンして、細胞表面のシアリルルイスX抗原の発現変化をフローサイトメトリーで調べたが変化がみられなかった。このことから細胞表面のシアリルルイス抗原キャリアータンパクは分子量250kDa以上のタンパクXであると考えられた。タンパクXに対する抗体で染色すると抗シアリルルイスX抗体と同様に細胞表面が染色された。
最終年度である今年度はCRISPR/Cas9を用いてシアリルルイスX抗原キャリアータンパクXのノックアウトを試みたが、タンパクX欠損細胞が得られなかった。タンパクXは生存に必須である可能性が考えられたので、誘導可能なCas9のシステムを構築中である。

研究成果

• [雑誌論文] Each GPI-anchored protein species forms a specific lipid raft depending on its GPI attachment signal. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miyagawa-Yamaguchi A, Kotani N, Honke K
  • 雑誌名: Glycoconj. J. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s10719-015-9595-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ganglioside GD3 enhances invasiveness of gliomas by forming a complex with platelet-derived growth factor receptor alpha and Yes. (2015)
  • 著者名/発表者名: 113.Ohkawa Y, Momota H, Kato A, Hashimoto N, Tsuda Y, Kotani N, Honke K, Suzumura A, Furukawa K, Ohmi Y, Natsume A, Wakabayashi T, Furukawa K
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: pii: jbc.M114.635755.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Segregation of lipid rafts revealed by the EMARS method using GPI-anchored HRP fusion proteins. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyagawa-Yamaguchi A, Kotani N, Honke K
  • 雑誌名: Trends Glycosci. Glycotech. 巻: 26 ページ: 59-69
  • DOI: 10.4052/tigg.26.59
  • 査読あり