Smad依存的スプライソソーム複合体形成と選択的スプライシンング

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670168
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 昭和薬科大学
• 研究代表者: 坂田 宣夫 昭和薬科大学, 薬学部, 講師 (00170598)
• 研究分担者: 伊東 進 昭和薬科大学, 薬学部, 教授 (70223154)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: シグナル伝達研究の新展開

研究概要

Smad 分子はTGF-βシグナル伝達で細胞内シグナル伝達分子として働くが、本研究では新たな役割としてスプライシング制御に関わる可能性を検討している。網羅的解析で同定されたSmad結合タンパク質のうち、スプライソソーム複合体構成分子のLUC7L3とSmad類の結合をCOS7細胞での大量発現系を用いる免疫共沈降法（Co-IP）で分析した。１）V5-Smad2、V5-Smad3、V5-Smad4とFlag-LUC7L3を用いたCo-IPで、LUC7L3とSmad2、LUC7L3と Smad3、LUC7L3とSmad4との結合は確認できなかった（V5でIP）。２）V5-Smad2、V5-Smad3とFlag-LUC7L3を用いたCo-IPで、LUC7L3とSmad2、LUC7L3と Smad3との結合は確認できなかった（FlagでIP）。３）V5-Smad2、V5-Smad3、V5-Smad4とFlag-LUC7L3を用いたCo-IPで、LUC7L3とSmad2、LUC7L3とSmad3との結合をTGF-βI型受容体構成的活性化体（ALK5ca）存在下、LUC7L3とSmad4との結合をALK5ca存在下、及び、BMPI型受容体構成的活性化体（ALK6ca）存在下検討したが結合を確認できなかった。４）V5-Smad1、V5-Smad5、V5-Smad8とFlag-LUC7L3を用いたCo-IPで、LUC7L3とSmad1、LUC7L3とSmad5、LUC7L3とSmad8との結合をALK6ca存在下検討したが結合を確認できなかった。５）V5-Smad6、V5-Smad7とFlag-LUC7L3を用いたCo-IPで、LUC7L3とSmad6、LUC7L3とSmad7との結合を確認できなかった。６）前記の5）と同様なCo-IPで、LUC7L3とSmad6、LUC7L3とSmad7との結合をALK5ca存在下、及び、ALK6ca存在下検討したが結合は確認できなかった。以上のように本研究では、現在までスプライソソーム複合体構成分子とSmad類の物理的会合を確認するに至っていない。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

実験計画の最初のステップであるスプライソソーム複合体構成分子LUC7L3とSmad類の物理的会合を確認出来ていない。その理由として次の事が考えられる。１）LUC7L3とSmadとの結合を他のスプライソソーム構成分子が干渉している。２）LUC7L3はSmadとは結合せず、他のTGF-βシグナル伝達分子と結合し、スプライシング機構に影響を与えている。３）LUC7L3のFlag tagがSmadとの結合を妨げている。

今後の研究の推進方策

他の因子等も含めたLUC7L3とSmadとの結合の検討、TGF-βシグナル伝達における他の分子との結合についても検討する必要がある。今後先ずはHepG2細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ法によりTGF-βシグナル伝達におよぼすLUC7L3の影響を検討する作業を進め、結合の確認に繋げていきたい。

研究成果

• [雑誌論文] ZFHX4 Interacts with the NuRD Core Member CHD4 and Regulates the Glioblastoma Tumor-Initiating Cell State. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yakov Chudnovsky, Riko Nishimura, Nobuo Sakata, Howard A. Fine, Anne E. Carpenter, Serena J. Silver, Roel G.W. Verhaak, Andrea Califano, Richard A. Young, Keith L. Ligon, Ingo K. Mellinghoff, David E. Root, David M. Sabatini, William C. Hahn, Milan G. Chheda, et al.
  • 雑誌名: Cell reports 巻: 6 ページ: 313-324
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2013.12.032
  • 査読あり
• [雑誌論文] C18 ORF1: A Novel Negative Regulator of TGF-β Signaling (2014)
  • 著者名/発表者名: Naoko Nakano, Kota Maeyama, Nobuo Sakata, Fumiko Itoh, Ryosuke Akatsu, Miki Nakata, Yuki Katsu, Souichi Ikeno, Yoko Togawa, Thao Thanh Vo Nguyen, Yukihide Watanabe, Mitsuyasu Kato, Susumu Itoh
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 289 ページ: 12680-12692
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.558981
  • 査読あり
• [学会発表] TGF-β Signaling Cooperates with AT Motif Binding Factor 1 (ATBF1) to Repress α-Fetoprotein Gene in Human Hepatoma Cells.
  • 著者名/発表者名: Nobuo Sakata, Satoshi Kaneko, Souichi Ikeno, Yutaka Miura, Hidekazu Nakabayashi, Taiki Tamaki, Naoko Nakano, Susumu Itoh
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
• [学会発表] 2.TGF-β signaling cooperate with ATBF1 in AFP transcription
  • 著者名/発表者名: Nobuo Sakata, Satoshi Kaneko, Souichi Ikeno, Yutaka Miura, Hidekazu Nakabayashi, Xue-Yuan Dong, Jin-Tang Dong, Taiki Tamaki, Naoko Nakano, Susumu Itoh
  • 学会等名: The 3rd International Symposium by JSPS Core-to-Core Program “Cooperative International Framework in TGF-β Family Signaling”
  • 発表場所: 大和屋本店（松山市）
• [学会発表] TGF-β/Smadシグナル伝達系と転写因子ATBF1によるα-fetoprotein遺伝子転写抑制
  • 著者名/発表者名: 坂田宣夫、金子哲士、池野聡一、三浦裕、中林秀和、Xue-Yuan Dong、Jin-Tang Dong、玉置大器、中野なおこ、伊東進
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（神戸市）