TALENによるノックアウトウサギモデルの作製と動脈硬化研究への応用

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670190
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 範 江林 山梨大学, 総合研究部, 教授 (60272192)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子改変ウサギ / 動脈硬化 / ノックアウト

研究実績の概要

本年度では、すでに作製されたアポEノックアウトウサギの解析を行い、以下の研究成果を得た。ホモ結合体のアポE欠損ウサギでは野生型ウサギと比べ血中の総コレステロールと中性脂肪の増加が見られた。また、血中のアポBが上昇しているが、アポAIの変化はなかった。超遠心法及びHPLC法により、リポタンパクの変化を検討したところ、アポE欠損ウサギには著しくレムナントリポタンパクの増加が認められた。これらのリポタンパクのアポB48の量がアポB100の量を上回っていることが確認できた。さらに、高脂肪食を2週間負荷させたところ、アポE欠損ウサギの総コレステロール値は1200 mg/dlまで上昇しており、高脂肪食に対する敏感性が非常に高いことが判明した。これらの結果から、アポE欠損ウサギは新しい高脂血症モデルになりうると考えられ、今後、動脈硬化研究にも応用できるかを見極めていきたいと考えている。現在はこれらの成果をまとめ、投稿中である。また、アポCIII欠損ウサギの繁殖を開始しており、ホモ結合体アポCIII欠損ウサギの獲得を目指している。
TALEN技術より作製されたアポAII遺伝子ノックインウサギはgermlineができず、Cas9技術により新たにアポAIIノックインウサギの作製を試みた。すでに出産した１７羽のウサギのうち、２羽がアポAII遺伝子のノックインがPCR法により確認された。今年の夏ころからの繁殖開始が期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

アポEとアポCIII欠損ウサギの作製と解析は順調に行われてきたが、アポAIIノックインの成功率が相当低い。それを克服するために、Cas9法を活用し、新たな技術で作製を行っている。

今後の研究の推進方策

今後は、アポCIII欠損ウサギの繁殖を行いながら、アポAIIノックインの成功を加速したい。また、アポCIII欠損ウサギの解析も早期に実現させたい。

研究成果

• [雑誌論文] Rabbit models for the study of human atherosclerosis: From pathophysiological mechanisms to translational medicine (2015)
  • 著者名/発表者名: Fan, J. Kitajima S, Watanabe T, Xu J, Zhang J, Liu E, Chen YE:
  • 雑誌名: Pharmacol Ther 巻: 146 ページ: 104-119
  • DOI: 10.1016/j.pharmthera.2014.09.009.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Bisphenol a exposure induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in hyperlipidemic rabbits. (2015)
  • 著者名/発表者名: Fang, C. Ning B, Waqar AB, Niimi M, Li S, Satoh K, Shiomi M, Ye T, Dong S, Fan J:
  • 雑誌名: Journal of Applied Toxicology 巻: 10 ページ: in press
  • DOI: 10.1002/jat.3103.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Carbonate ion-enriched hot spring water promotes skin wound healing in nude rats. (2015)
  • 著者名/発表者名: Liang, J. Kang D, Wang Y, Yu Y, Fan J, Takashi E:
  • 雑誌名: Plos One 巻: 10 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110977
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Bisphenol a exposure enhances atherosclerosis in whhl rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Fang, C. Ning B, Waqar AB, Niimi M, Li S, Satoh K, Shiomi M, Ye T, Dong S, Fan J:
  • 雑誌名: Plos One 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110977
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Silencing herpes simplex virus type 1 capsid protein encoding genes by sirna: A promising antiviral therapeutic approach. (2014)
  • 著者名/発表者名: Jin, F. Li S, Zheng K, Zhuo C, Ma K, Chen M, Wang Q, Zhang P, Fan J, Ren Z, Wang Y:
  • 雑誌名: Plos One 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110977
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Probucol suppresses macrophage infiltration and mmp expression in atherosclerotic plaques of whhl rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Li, Shen. Liang J, Niimi M, Bilal Waqar A, Kang D, Koike T, Wang Y, Shiomi M, Fan J:
  • 雑誌名: J Atheroscler Thromb 巻: 21 ページ: 648-658
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Urotensin ii promotes atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Li, Y. Zhao S, Wang Y, Chen Y, Lin Y, Zhu N, Zheng H, Wu M, Cheng D, Bai L, Fan J, Liu E:
  • 雑誌名: Plos One 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0095089
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of antisense oligonucleotides against c-reactive protein on the development of atherosclerosis in whhl rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yu, Q. Liu Z, Waqar AB, Ning B, Yang X, Shiomi M, Graham MJ, Crooke RM, Liu E, Dong S, Fan J:
  • 雑誌名: Mediators Inflamm 巻: 2014 ページ: -
  • DOI: 10.1155/2014/979132
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Demonstration of an add-on effect of probucol and cilostazol on the statin-induced anti-atherogenic effects. (2014)
  • 著者名/発表者名: Wang, Y. Bai L, Lin Y, Guan H, Zhu N, Chen Y, Li Y, Gao S, Zhao S, Fan J, Liu E:
  • 雑誌名: Histol Histopathol 巻: 29 ページ: 1593-1600
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effective gene targeting in rabbits using RNA-guided Cas9 nucleases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yang, D. Xu J, Zhu T, Fan J, Lai L, Zhang J, Chen Y:
  • 雑誌名: J Mol Cell Biol. 巻: 6 ページ: 97-99
  • DOI: 10.1093/jmcb/mjt047
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Normal calorific diet enriched fat and fructose leads to multiple metabolic disorders and enhances atherosclerosis in WHHL rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ning, B., Wang, X., Yu, Y., Waqar, AB., Shiomi, M., Fan, J.
  • 学会等名: MSDA2014
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-09-13 – 2014-09-13
• [学会発表] Recent progress in rabbit genome: LaGomiCs? (2014)
  • 著者名/発表者名: Fan, J.
  • 学会等名: 第二回中‐日ウサギ動物モデル研究会
  • 発表場所: 吉林大学和平校区（中国）
  • 年月日: 2014-08-08 – 2014-08-08
• [学会発表] Probucol inhibits the initiation of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. (2014)
  • 著者名/発表者名: Niimi, M.
  • 学会等名: 第二回中‐日ウサギ動物モデル研究会
  • 発表場所: 吉林大学和平校区（中国）
  • 年月日: 2014-08-08 – 2014-08-08
• [学会発表] Revised protocol to analyze rabbit coronary atherosclerosis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Li, S., Waqar AB., Fan, J.
  • 学会等名: 第3回ウサギバイオサイエンス研究会
  • 発表場所: 山梨大学甲府キャンパス（山梨県甲府市）
  • 年月日: 2014-08-02 – 2014-08-02
• [学会発表] Hypertension enhances atherosclerosis and destabilizes plaques. (2014)
  • 著者名/発表者名: Waqar, AB., Ning, B., Liu, Z., Shiomi, M., Fan, J.
  • 学会等名: 第46回日本動脈硬化学会総会・学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 2014-07-11 – 2014-07-11
• [学会発表] Conditional knockout of macrophage MED1 increases atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor-deficient mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Bai, L., Li, Q., Liu, R., Lin, Y., Wang, Y., Chen, Y., Li, Y., Zhao, S., Wang, W., Jia, Y., Fan, J., Reddy, JK., Liu, E.
  • 学会等名: 第46回日本動脈硬化学会総会・学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテ（東京都新宿区）
  • 年月日: 2014-07-11 – 2014-07-11
• [備考] 山梨大学大学院医学工学総合研究部分子病理学講座
  • URL: http://www.med.yamanashi.ac.jp/clinical_basic/pathol01/