再生医療技術を利用した新規HIV-1感染サルモデルの作成

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670218
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 塩田 達雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00187329)
• 研究分担者: 明里 宏文 京都大学, 霊長類研究所, 教授 (20294671)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: HIV-1 / iPS細胞 / 再生医療技術 / T細胞 / サル

研究概要

後天性免疫不全症候群（AIDS）の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）は宿主域が狭く、ヒト以外に感染する動物はチンパンジーのみであり、アカゲザル、カニクイザル等の旧世界ザルやマーモセット等の新世界サルには感染しない。従って感染予防ワクチンの有効性を実験的に検定することが困難であり、ワクチン開発の大きな障害の一つとなっている。本研究は、サルの人工多能(iPS)細胞に遺伝子操作を加えて、HIV-1が個体内で感染・増殖できるサルを作出することを目的とする。
今年度は、採取の比較的容易なアカゲザル末梢血細胞を出発材料としてiPS細胞樹立・維持条件の最適化を試みた。アカゲザル末梢血から末梢血単核球を分離し、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc のいわゆる山中4因子を発現するセンダイウイルスベクターを用いてiPS 細胞の樹立を複数回試みた。当初、山中4因子を発現する4種類のセンダイウイルスベクターを用いてiPS 細胞の樹立を試みたが、得られた細胞の遺伝子発現をRT-PCRにて解析した結果、センダイウイルスベクターの感染は確認できるものの、形態およびアルカリフォスファターゼ活性により未分化性iPS細胞樹立と同定することはできなかった。アカゲザルのiPS細胞はヒトやカニクイザルに比して樹立・維持が困難である可能性が考えられた。そこで山中4因子が1つのセンダイウイルスベクターにすべて発現しているものを用い、さらに、いくつかの培養条件を最適化したところ、最終的にembryonic stem cell様の形態を示すコロニーを樹立・維持ができるようになった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初、文献的検索から、HIV-1の近縁ウイルスであるサル免疫不全ウイルスの感染モデルとして良く使用されるアカゲザルについてもiPS細胞作製が既に報告されていたために、アカゲザルの血液由来細胞を用いてiPS細胞の樹立を試みたが、樹立には至らなかった。そこでよりiPS細胞化の効率のよいウイルスべクターを使用し、さらに培養条件も広い範囲で検討して最適化したとろ、最終的にiPS細胞様の形態を示す細胞株の樹立に至った。この培養条件の最適化に当初の予想を遥かに越える時間を要したために、今年度は、当初計画していたiPS細胞からのT細胞への分化やそれらのサル個体への移植には至らなかった。しかし、当初参照したアカゲザルからのiPS細胞樹立の文献を再精査したところ、記載されているPCR用プライマーの配列から、用いられたサルはアカゲザルではなくカニクイザルであった可能性が考えられたため、我々の今年度の成果は、世界で始めてのアカゲザルのiPS細胞の樹立、となる可能性がある。アカゲザルとカニクイザルはヒトのモデルとしてそれぞれ別個の特徴を有しており、アカゲザルにおけるiPS細胞の樹立は再生医療技術全般の発展に寄与する可能性がある。

今後の研究の推進方策

得られたiPS細胞様の細胞株の種々の万能化マーカーを詳細に検討して、iPS細胞であるか否かの検討を行う。一方、確実なiPS細胞化が既に複数回報告されているカニクイザルについてもiPS細胞化を行う。Schmittらの方法（Schmitt et al. Nature Immunology 2004, 5:410-417）に従い、得られたサルのiPS細胞とNotchリガンドを発現させたマウスのstromal cellの共培養にIL7やFlt-3のリガンドを加えて、CD4陽性CD8陽性の未成熟T細胞を得る。一方、iPS細胞を樹立した幼弱サル個体の胸腺組織にその未成熟T細胞を移植する。既に当初の計画から遅れているために、蛍光マーカー発現のみならず、HIV-1のrestriction factorであるTRIM5αやAPOBEC3Gの発現を人為的に抑制させたiPS細胞の移植を試みる。

次年度の研究費の使用計画

平成25年度は計画の一部しか達成できず、大阪大学においてはサル細胞からのiPS細胞化のみの費用、京都大学ではサルからの採血の費用のみが生じた。
本年度は前年度の研究費を含め、遅れを取り戻すために、全体としては当初の予定どおりの計画を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Divergence and diversity of ULBP2 genes in rhesus and cynomolgus macaques. (2014)
  • 著者名/発表者名: Naruse TK, Akari H, Matano T, Kimura A
  • 雑誌名: Immunogenetics 巻: 66 ページ: 161-170
  • DOI: 10.1007/s00251-014-0760-y. Epub 2014 Jan 28.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Seroprevalence of Japanese encephalitis virus infection in captive Japanese macaques (Macaca fuscata). (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimoda H, Saito A, Noguchi K, Terada Y, Kuwata R, Akari H, Takasaki T, Maeda K
  • 雑誌名: Primates 巻: 55 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s10329-014-0421-7.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Demonstration of marmosets (Callithrix jacchus) as a non-human primate model for secondary dengue virus infection: high levels of viremia and serotype cross-reactive antibody responses consistent with secondary infection of humans. (2014)
  • 著者名/発表者名: Moi ML, Takasaki T, Omatsu T, Nakamura S, Katakai Y, Ami Y, Yuriko S, Saijo M, Akari H, Kurane I
  • 雑誌名: Journal of General Virology 巻: 95 ページ: 591-600
  • DOI: 10.1099/vir.0.060384-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Moderate Restriction of Macrophage-Tropic Human Immunodeficiency Virus Type 1 by SAMHD1 in Monocyte-Derived Macrophages. (2014)
  • 著者名/発表者名: Taya K, Nakayama EE, Shioda T.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0090969.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of rhesus macaque-tropic HIV-1 clones that are resistant to major anti-HIV-1 restriction factors. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nomaguchi M, Yokoyama M, Kono K, Nakayama EE, Shioda T, Doi N, Fujiwara S, Saito A, Akari H, Miyakawa K, Ryo A, Ode H, Iwatani Y, Miura T, Igarashi T, Sato H, Adachi A.
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 87 ページ: 11447-11461
  • DOI: 10.1128/JVI.01549-13.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Slower Uncoating Is Associated with Impaired Replicative Capability of Simian-Tropic HIV-1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kono K, Takeda E, Tsutsui H, Kuroishi A, Hulme AE, Hope TJ, Nakayama EE, Shioda T.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0072531.
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRIM5 genotypes in cynomolgus monkeys primarily influence inter-individual diversity in susceptibility to monkey-tropic human immunodeficiency virus type 1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Saito A, Nomaguchi M, Kono K, Iwatani Y, Yokoyama M, Yasutomi Y, Sato H, Shioda T, Sugiura W, Matano T, Adachi A, Nakayama E, Akari H.
  • 雑誌名: J Gen Virol. 巻: 94 ページ: 1318-24
  • DOI: 10.1099/vir.0.050252-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Systemic biological analysis of the mutations in two distinct HIV-1mt genomes occurred during replication in macaque cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nomaguchi M, Doi N, Fujiwara S, Saito A, Akari H, Nakayama EE, Shioda T, Yokoyama M, Sato H, Adachi A.
  • 雑誌名: Microbes Infect. 巻: 15 ページ: 319-28
  • DOI: 10.1016/j.micinf.2013.01.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A naturally occurring single amino acid substitution in human TRIM5α linker region affects its anti-HIV-1 activity and susceptibility to HIV-1 infection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakayama EE, Nakajima T, Kaur G, Mimaya JI, Terunuma H, Mehra N, Kimura A, Shioda T.
  • 雑誌名: AIDS Res Hum Retroviruses. 巻: 29 ページ: 919-24
  • DOI: 10.1089/AID.2012.0369.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient in vivo depletion of CD8+ T lymphocytes in common marmosets by novel CD8 monoclonal antibody administration. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Suzuki S, Iwasaki Y, Kaneko A, Saito A, Enomoto Y, Higashino A, Watanabe A, Suzuki J, Inoue K, Kuroda T, Takada M, Ito R, Ito M, Akari H
  • 雑誌名: Immunology Letters 巻: 154 ページ: 12-17
  • DOI: 10.1016/j.imlet.2013.08.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of simian T-cell leukemia virus type 1 in naturally infected Japanese macaques as a model of HTLV-1 infection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miura M, Yasunaga J, Tanabe J, Sugata K, Zhao T, Ma G, Miyazato P, Ohshima K, Kaneko A, Watanabe A, Saito A, Akari H, Matsuoka M
  • 雑誌名: Retrovirology 巻: 10 ページ: 118
  • DOI: 10.1186/1742-4690-10-118.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Macaque-tropic human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1mt): Break out of the host factors. (2013)
  • 著者名/発表者名: Saito A, Akari H
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 4 ページ: 187
  • DOI: 10.3389/fmicb.2013.00187.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Presence of viral genome in urine and development of hematuria and pathological changes in kidneys in common marmoset (Callithrix jacchus) after inoculation with dengue virus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Moi ML, Omatsu T, Hirayama T, Nakamura S, Katakai Y, Yoshida T, Saito A, Tajima S, Ito M, Takasaki T, Akari H, Kurane I
  • 雑誌名: Pathogens 巻: 2 ページ: 357-363
  • DOI: 10.3390/pathogens2020357.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamics of cellular immune responses in the acute phase of dengue virus infection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Omatsu T, Saito A, Katakai Y, Iwasaki Y, Kurosawa T, Hamano M, Higashino A, Nakamura S, Takasaki T, Yasutomi Y, Kurane I, Akari H
  • 雑誌名: Archives of Virology 巻: 158 ページ: 1209-1220
  • DOI: 10.1007/s00705-013-1618-6.
  • 査読あり
• [学会発表] レトロウイルスのGagAUG および翻訳とゲノムパッケージングに関する解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 櫻木 淳一,夏井 洋和,櫻木 小百合,塩田 達雄
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県）
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] マクロファージ指向性 HIV-1も、マクロファージおよび単球において SAMHD1 による増殖抑制を受けている (2013)
  • 著者名/発表者名: 田谷かほる、中山英美、塩田達雄
  • 学会等名: 第27回日本エイズ学会学術集会・総会
  • 発表場所: 市民会館崇城大学ホール（熊本県）
  • 年月日: 20131120-20131122
• [学会発表] HIVサブタイプ比較によるゲノムパッケージングに関する解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 櫻木淳一、櫻木小百合、塩田達雄
  • 学会等名: 第27回日本エイズ学会学術集会・総会
  • 発表場所: 市民会館崇城大学ホール（熊本県）
  • 年月日: 20131120-20131122
• [学会発表] 可視化ウイルスをつかったHIV-2カプシドコアの脱核速度測定法の確立 (2013)
  • 著者名/発表者名: 武田英里、河野健、Hulme Amy E.、Hope Thomas J.、中山英美、塩田達雄
  • 学会等名: 第61回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県）
  • 年月日: 20131110-20131112
• [学会発表] レンチウイルスのGag開始コドンおよび翻訳とゲノムパッケージングに関する解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 櫻木淳一、夏井洋和、櫻木小百合、塩田達雄
  • 学会等名: 第61回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県）
  • 年月日: 20131110-20131112
• [学会発表] Moderate restriction of macrophage tropic human immunodeficiency virus type 1 by SAMHD1 in monocyte-derived macrophages. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kahoru Taya, Emi E Nakayama, Shioda Tatsuo
  • 学会等名: 第12回あわじしま感染症・免疫フォーラム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県）
  • 年月日: 20130910-20130913
• [学会発表] Slower uncoating is associated with impaired replicative capability of simian-tropic HIV-1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Eri Takeda, Ken Kono, Hiromi Tsutsui, Ayumu Kuroishi, Amy E. Hulme, Thomas J. Hope, Emi. E Nakayama, Tatsuo Shioda
  • 学会等名: 第12回あわじしま感染症・免疫フォーラム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県）
  • 年月日: 20130910-20130913
• [学会発表] Relationship between genome packaging and Gag translation of various mammal retroviruses. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sayuri Sakuragi, Hirokazu Natsui, Tatsuo Shioda, Jun-ichi Sakuragi
  • 学会等名: The 25th Workshop on Retroviral Pathogenesis
  • 発表場所: アイスランド大学（アイスランド）
  • 年月日: 20130807-20130810