RORγt陽性自然リンパ球を特異的に欠損するマウスの作成

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670228
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 澤 新一郎 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80611756)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 免疫学 / 発生・分化 / 細胞・組織

研究概要

本研究ではloxp配列およびサル由来ジフテリア毒素受容体(DTR)配列を持ち、自然リンパ球系列を特異的に生体内から除去可能なトランスジェニックマウスの作出を目的とする。loxp配列で挟まれたDTR-EGFP配列をタイプ３自然リンパ球(ILC3)のマスター制御因子RORgtのプロモーター直下に挿入したBacterial Artificial Chromosome (BAC)トランスジェニックマウスを作成後、T細胞系列特異的にリコンビナーゼCreを発現するLck-Creマウスと交配し、T細胞以外のRORgt陽性細胞、つまりILC3をジフテリア毒素依存的に除去する。Loxp-DTREGFP-loxp配列をpCDNA3.1発現ベクターに挿入後、ストローマ細胞株に遺伝子導入したところ、良好なEGFP発現が得られ、リコンビナーゼCreの共発現によるEGFP発現消失が確認できた。このコンストラクトをSK3.1 shuttleベクターに挿入後、RORgt遺伝子を持つBAC DNAで組替えを行った。この組替えBAC DNAをC57BL6マウス受精卵にインジェクションし、ファウンダーを得た。しかし、これらのマウスの胸腺および腸管におけるEGFP発現はスクリーニングした３系統からは現在得られていない。挿入したLoxp-DTREGFP-loxp配列のうち、(1)５‘側のloxpとDTREGFP配列間の塩基数が十分に取っていない (2) EGFP配列と3’側のloxpの間にpolyA配列を挿入しなかったことが、in vovoにおける挿入遺伝子の十分な発現を認めない原因であったと考えられる。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初計画したトランスジーンの生体内における発現が認められなかったことから、計画の再検討が必要となった。

今後の研究の推進方策

Loxp-DTREGFP-loxp配列のうち、5’側のloxpとDTRの間に10塩基のスペーサーを設けると同時にEGFP-loxp間にpolyA配列を挿入する。また、EGFP-polyA-loxp-IRES-DTR-loxP配列を新たに構築し、より発現効率が高いトランスジーンの検討後、当初計画したマウス作成を完結させる。

研究成果

• [雑誌論文] Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis (2014)
  • 著者名/発表者名: Komatsu, N., Okamoto, K., Sawa, S., Nakashima, T., Oh-Hora, M., Kodama, T., Tanaka, S., Bluestone, J.A., Takayanagi, H.
  • 雑誌名: Nature Medicine 巻: 20 ページ: 62-68
  • DOI: 10.1038/nm.3432
  • 査読あり
• [雑誌論文] 自然リンパ球と腸管免疫 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤 新一郎
  • 雑誌名: 皮膚アレルギーフロンティア 巻: 11 ページ: 50-51
• [学会発表] Chasing fates of innate lymphoid cell (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinichiro SAWA
  • 学会等名: New Perspectives in Basic and Applied Immunology Symposium
  • 発表場所: ドイツ癌研究センター（ハイデルベルグ）
  • 年月日: 20130930-20131002
  • 招待講演
• [学会発表] Do RORgt+ innate lymphoid cells play critocal role in the intestinal immunity? (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinichiro SAWA
  • 学会等名: Kyoto T cell Conference
  • 発表場所: 京都大学
  • 年月日: 20130603-20130607
  • 招待講演