人工制限酵素を用いたミトコンドリアDNAへの変異導入法の開発と確定診断への応用

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670261
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 八塚 由紀子 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20458524)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ミトコンドリアDNA / 遺伝子診断・治療 / 人工制限酵素 / 遺伝子工学

研究実績の概要

ミトコンドリア呼吸鎖異常症（MRCD）は電子伝達系の機能不全によって生じる遺伝病である。これまでMRCD患者のミトコンドリアDNA（mtDNA）全周配列解析で同定した新規変異を病因変異であると確定するには、Cybrid細胞を作製し評価する方法をとって来た。しかし、患者由来細胞が必須である等制限が多いため、新たな診断法を模索している。
今年度は、初年度に作製したミトコンドリア局在型人工制限酵素（mito-fokI）にTALEドメインを挿入し“ミトコンドリア局在型TALEN”を完成させた。次に、Single Strand Annealing Assay（SSAアッセイ）の実験系を立ち上げ、標的mtDNA配列をクローニングした評価用レポーターベクターでSSAアッセイを行い、作製した“ミトコンドリア局在型TALEN”が期待どおりの認識＋切断活性を発揮することを確認した。
また、近年、TALENを含むミトコンドリア移行型人工制限酵素を開発し、主に治療目的で変異mtDNAを切断、除去できるという研究成果が複数報告されて来ている。しかし、本研究で目標とする「人工制限酵素によるmtDNAへの変異ノックイン」に関しては未だ報告がなく、早期の開発が期待される。今年度は前述のミトコンドリア局在型TALEN作製に併行して、変異ノックイン用１本鎖オリゴDNAをミトコンドリアへ運ぶデリバリーシステムの開発にも着手した。
具体的には、まずN末端にミトコンドリア移行シグナル（MTS）を持つ、１本鎖オリゴDNAデリバリー用融合タンパクを数種類作製し、細胞内での発現とミトコンドリアへの移行、さらにミトコンドリア内でのMTS切断をウェスタンブロットで確認した。次にこれらMTS融合タンパクに対するリガンドと１本鎖オリゴDNAをカップリング反応で連結した。リガンド連結１本鎖オリゴDNAのトランスフェクション法について数種の方法で条件検討を行い、siRNAリポフェクションと同様の方法で細胞内に導入できることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

今年度は、初年度に作製したミトコンドリア局在型人工制限酵素（mito-fokI）に、mtDNA上の特定の配列を認識させるためのドメイン（TALE）を挿入し、“ミトコンドリア局在型TALEN”を完成させた。次に、TALENが標的配列を特異的に認識し切断することを検証する実験系としてSingle Strand Annealing Assay（SSAアッセイ）を立ち上げ、作製した“ミトコンドリア局在型TALEN”と標的mtDNA配列をクローニングした評価用レポーターベクターでSSAアッセイを行ったところ、標的mtDNA配列を認識かつ切断することが確認された。
また、TALENは「Right」と「Left」の2種類をセットで細胞内に導入しなくてはならない。そこで、両方のTALENが導入された細胞のみ選択できるよう、それぞれのTALEN発現ベクターにIRES-EGFPあるいはIRES-mCherryをつないだものを作製して細胞に導入したところ、緑色（EGFP由来）および橙色（mCherry由来）の2種の蛍光を発する細胞が得られた。今後これらをセルソーティング等に使用する予定である。
さらに、１本鎖オリゴDNAをミトコンドリアに効率的に移行させる手段として、ミトコンドリア移行シグナル（MTS）融合タンパクとそのリガンドを使用する方法の開発を試みた。当初はMTSのペプチド配列を修飾させたオリゴDNAの使用を計画していたが、MTSとオリゴDNAを分けることで、より汎用性が高くなると考えて可能性を検討した。初年度のmito-fokI作製時の実験結果を参考に数種類のMTS融合タンパクを作製、細胞内での発現量やミトコンドリア移行能を評価し、最終的に2種類のMTSに絞った。現在、前述のデリバリーシステムが働くかどうかテストを行っているが、1本鎖オリゴDNAをミトコンドリアに到達したものと細胞質に留まったものとで分けて検出する必要があるので、まずは蛍光標識した1本鎖オリゴDNAを使用して、その細胞内局在を顕微鏡下で直接観察できないか調べている。

今後の研究の推進方策

実際にTALENのTALEドメインをデザインしてみると、色々と制約が生じることが分かった。例えば、mtDNA上の標的配列付近に偶然にも核DNAと類似した配列が存在し、デザインの自由度が極端に低くなることがあった。さらに、開発者の異なる2種類のデザインツールを利用してTALEをデザインしたところ、標的配列を同じ領域に設定しても出力される結果は必ずしも一致しないことが分かった。今後、作製数を重ねることで、より適した設計を選べるようになると考えている。
本研究においては、1つの細胞内に多数のコピーが存在するmtDNAを編集の対象とするため、ミトコンドリア局在型TALENの発現量や標的配列切断活性は高いほど良いと考えられる。今回使用している2種類に加え、他のツールでデザインしたミトコンドリア局在型TALENでも、認識＋切断活性を比較評価したいと考えている。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額が36,821円生じているが、これは当該年度の期末に購入しようとしていた「変異検出キット」の購入を見合わせたためである。

次年度使用額の使用計画

次年度、「変異検出キット」は確実に必要となる。様々なメーカーが様々な製品を出しており、より性能の高い新製品も発売される中、本研究の使用目的に合致する製品を早急に選出し使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Myocerebrohepatopathy spectrum disorder due to POLG mutations: A clinicopathological report. (2014)
  • 著者名/発表者名: Montassir H, Maegaki Y, Murayama K, Yamazaki T, Kohda M, Ohtake A, Iwasa H, Yatsuka Y, Okazaki Y, Sugiura C, Nagata I, Toyoshima M, Saito Y, Itoh M, Nishino I, Ohno K.
  • 雑誌名: Brain & development 巻: S0387-7604(14) ページ: 261-267
  • DOI: doi: 10.1016/j.braindev.2014.10.013.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Large-scale comprehensive identification and analysis of causative genes in mitochondrial respiratory chain disorder (2014)
  • 著者名/発表者名: Y Kishita, Y Tokuzawa, M Kohda, Y Moriyama, Y Yamashita-Sugahara, S Tamaru, H Tochigi, Y Mizuno, N Uehara, Y Nakachi, Y Yatsuka, H Nyuzuki, S Suzuki, NN Borna, T Hirata, N Matoba, H Kato, A Okuda, M Mori, M Ajima, H Harashima, T Yamazaki, K Murayama, A Ohtake, Y Okazaki
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] A comprehensive genomic analysis of 144 patients with mitochondrial respiratory chain deficiencies. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masakazu Kohda, Yoshimi Tokuzawa, Yoshihito Kishita, Yzumi Yamashita-Sugahara, Yosuke Mizuno, Yutaka Nakachi, Tomoko Hirata, Yukiko Kanesaki-Yatsuka, Hiroko Harashima, Taro Yamazaki, Masato Mori, Kei Murayama, Hidemasa Kato, Akira Ohtake, Yasushi Okazaki
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第59回大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] A comprehensive genomic analysis for mitochondrial respiratory chain disorder. (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Kohda, Y. Tokuzawa, Y. Kishita, Y. Yamashita-Sugahara, Y. Mizuno, Y. Nakachi, Y. Moriyama, T. Hirata, Y. Kanesaki-Yatsuka, H. Harashima, M. Ajima, T. Yamazaki, M. Mori, K. Murayama, H. Kato, A. Ohtake, Y. Okazaki
  • 学会等名: アメリカ人類遺伝学会（ASHG2014）
  • 発表場所: サンディエゴ（米カリフォルニア）
  • 年月日: 2014-10-18 – 2014-10-22
• [備考] 文部科学省 革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）先導研究 課題A
  • URL: http://www.cell-innovation.org/html/program/theme_010_okazaki.html
• [備考] 埼玉医科大学ゲノム医学研究センター
  • URL: http://www.saitama-med.ac.jp/genome/
• [備考] 埼玉医科大学ゲノム医学研究センター(ゲノム科学部門）
  • URL: http://www.saitama-med.ac.jp/genome/Div05_FGSM/index.html