人工制限酵素を用いたミトコンドリアDNAへの変異導入法の開発と確定診断への応用

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25670261
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 八塚 由紀子 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20458524)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ミトコンドリアDNA / 遺伝子診断・治療 / 人工制限酵素 / 遺伝子工学

研究実績の概要

ミトコンドリア呼吸鎖異常症（Mitochondrial Respiratory Chain Disorder：MRCD）は電子伝達系の機能不全によって生じる遺伝病である。当研究室では、MRCD患者のミトコンドリアDNA（mtDNA）全周解析により変異同定を行っている。新規変異の病因性検証にはCybrid法を用いるが、「患者由来細胞が必須」という制約がある。今回、ゲノム編集技術を応用して入手が容易な株細胞から任意のmtDNA変異細胞を作製し評価する、という新たな評価法の構築に挑戦した。
ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9といった人工制限酵素の中から、より柔軟に塩基配列結合部位の設計が可能で、off-target効果も比較的低いとされるTALENを選択、これにミトコンドリア移行シグナル（MTS）を付加し、ミトコンドリア局在型へと改変した。
MTSは10種類を比較検討した。ミトコンドリアゲノム上の異なる配列を認識するミトコンドリア局在型TALENを作製し、それぞれの認識および切断活性をSingle Strand Annealing Assay（SSAアッセイ）で測定したところ、1塩基違いの読み分けも可能な厳格な配列認識能を持つことが確認された。そして、ミトコンドリア局在型TALEN導入細胞が実際にミトコンドリアDNA枯渇（Mitochondrial depletion）を起こすことも確認された。
本研究の最終目標は＜変異ノックイン＞である。（主に治療目的で行う）mtDNAの＜変異除去＞は人工制限酵素のみで達成できるが、＜変異ノックイン＞は人工制限酵素と共に変異ドナーもミトコンドリアへ運ぶ必要がある。そこで、変異ドナーであるsingle strand DNAやplasmid DNAをどのようにミトコンドリアへ運ぶか、という点についても詳細な検討を行った。

研究成果

• [雑誌論文] A Comprehensive Genomic Analysis Reveals the Genetic Landscape of Mitochondrial Respiratory Chain Complex Deficiencies. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kohda M, Tokuzawa Y, Kishita Y, Nyuzuki H, Moriyama Y, Mizuno Y, Hirata T, Yatsuka Y, et al.
  • 雑誌名: PLoS Genetics. 巻: 12(1) ページ: e1005679
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005679. eCollection 2016 Jan.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Myocerebrohepatopathy spectrum disorder due to POLG mutations: A clinicopathological report. (2015)
  • 著者名/発表者名: Montassir H, Maegaki Y, Murayama K, Yamazaki T, Kohda M, Ohtake A, Iwasa H, Yatsuka Y, Okazaki Y, Sugiura C, Nagata I, Toyoshima M, Saito Y, Itoh M, Nishino I, Ohno K
  • 雑誌名: Brain & Development 巻: 37(7) ページ: 719-724
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2014.10.013. Epub 2014 Nov 18.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] A comprehensive genomic analysis reveals the genetic landscape of mitochondrial respiratory chain complex deficiencies. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masakzu Kohda, Yoshimi Tokuzawa, Yoshihito Kishita, Hiromi Nyuzuki, Yosuke Mizuno, Tomoko Hirata, Yukiko Yatsuka, et al.
  • 学会等名: 第15回日本ミトコンドリア学会年会
  • 発表場所: 福井県国際交流会館（福井県福井市）
  • 年月日: 2015-11-19 – 2015-11-20
  • 国際学会
• [学会発表] 全エキソーム解析で病因を同定したミトコンドリア呼吸鎖異常症の出生前遺伝子診断 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山崎太郎、原嶋宏子、伏見拓矢、志村 優、八塚由紀子、木下善仁、神田将和、岡崎康司、村山 圭、大竹 明
  • 学会等名: 第13回 アジア先天代謝異常症シンポジウム
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2015-11-12 – 2015-11-14
  • 国際学会
• [学会発表] ミトコンドリア呼吸鎖複合体異常症のゲノム解析と新規原因遺伝子の発見 (2015)
  • 著者名/発表者名: 神田 将和、徳澤 佳美、木下 善仁、森山 陽介、水野 洋介、平田 智子、八塚 由紀子、菅原 泉、仲地 豊、加藤 英政、田丸 俊輔、入月 浩美、Nurun Nahar Borna、原嶋 宏子、山崎 太郎、森雅人、村山 圭、大竹 明、岡崎 康司
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会 第60回大会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 2015-10-14 – 2015-10-17
• [備考] MO Bank
  • URL: http://mo-bank.com/index.html