| 研究課題/領域番号 |
25670290
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設) |
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研究代表者 |
富永 真琴 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (90260041)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 生理学 |
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| 研究実績の概要 |
マウス感覚神経にExon20を欠失したスプライスバリアントTRPA1bを見いだした。生化学的解析によってTRPA1bはfull length TRPA1 (TRPA1a)と物理的に結合していることが分かった。また、TRPA1bはTRPA1aの形質膜移行あるいは形質膜への滞在を促進して形質膜のTRPA1a量を増大させてTRPA1の機能を増強させていることがパッチクランプ法を用いた電気生理学的実験で分かった。このTRPA1bによるTRPA1応答の増強はHEK293細胞を用いた異所性発現系のみならず、マウス感覚神経細胞でも確認された。また、マウスの炎症性疼痛モデルと神経障害性疼痛モデルにおいて、TRPA1a遺伝子の発現増加は一過的であったが、TRPA1b遺伝子は持続的に増加しており、このTRPA1bの増加がTRPA1機能増強を介して炎症性疼痛および神経障害性疼痛発生をもたらしているものと考えられた。このスプライスバリアントTRPA1bの発現を異なる疼痛マウスモデルで検証するとともに、TRPA1a, TRPA1bを別々に認識する抗体作製を目指した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
① 疼痛モデルマウスにおけるTRPA1bの発現増大に関与するかもしれない転写因子のスクリーニングを行ったが、大きく変化するものは発見できなかった。レーザー熱刺激での熱痛覚過敏モデルマウスでのTRPA1の関与とTRPA1bの関与の解析を進めたが、CFA炎症性疼痛モデルマウスや座骨神経部分結紮神経障害性モデルマウスに見られたようなTRPA1bの強い関与を見いだすことはできず、TRPA1bの関与は疼痛モデル依存的であるものと推定された。③ TRPA1bの発現増加を蛋白質レベルで確認すべくTRA1bを特異的に認識する抗体の作成を行ったが、今のところ、よい抗体はできていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの成果を踏まえ、次のことを進めたい。① 平成26年に試行したのとは異なる疼痛モデルマウスを作成して、疼痛関連行動（自発痛）の解析、機械刺激痛覚過敏のvon Frey試験での定量化解析、レーザー熱刺激での熱痛覚過敏行動の定量解析を野生型マウス、TRPA1欠損マウスで行い、それら疼痛モデルへのTRPA1の関与とTRPA1bの関与の体系的解析を進める。また、患側と健側のL4-L6DRGを取り出し、TRPA1a, TRPA1b遺伝子の発現をreal-time PCR法で定量解析する。また、経時的に採取したDRG細胞のTRPA1機能変化をAITCに対する応答を指標としてCa2+イメージング法で検討する。② 引き続き、TRPA1bの発現増加を蛋白質レベルで確認すべく、TRA1bを特異的に認識する抗体の作成を行う。③ TRPA1の進化解析に関しては、恒温動物であるニワトリのTRPA1が熱センサーであることが分かり、哺乳類に進化して熱刺激感受性が失われたことが推定されるので、複数種の哺乳類のTRPA1遺伝子クローニングを進めるとともに、現時点では温度感受性がないとされている魚類（ゼブラフィッシュ）TRPA1の温度感受性解析を進め、アミノ酸レベルでのアラインメント比較解析から熱刺激に関わるドメインもしくはアミノ酸の同定を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成25年度研究で、マウスTRPA1のalternative splicing variantの論文を発表することができ、平成26年度に上記に示す実験を行ったが、十分な結果を得ることができなかった。平成26年度には多くの研究経費を使う実験が多くなく、平成27年度への研究費の繰越しを決断した。挑戦的萌芽研究の支援は平成26年度までだが、当初の計画を出来るだけ早く完遂できるように実験を進めたい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
マウスの疼痛モデルを作成するために、実験動物の購入に多くの研究費をあてる。実験には野生型マウスとTRPA1欠損マウスを用いるが、TRPA1欠損マウスは十分に戻し交配をしているので、コントロールの野生型マウスは業者から購入したマウスを使うことを計画しており、その購入費用にあてる。また、TRA1bを特異的に認識する抗体の作成は抗原ペプチドの作成およびウサギ免疫、血清精製までを業者に引き続き委託し、その経費に繰り越した研究費を使用したい。
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