| 研究課題/領域番号 |
25670341
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
馬淵 正 山梨大学, 医学工学総合研究部, 助教 (80150308)
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| 研究分担者 |
猩々 英紀 山梨大学, 医学工学総合研究部, 准教授 (60284626)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 法医学 / 年齢推定 / NUMITS / ミトコンドリアDNA / DNA二本鎖切断 / 非相同末端連結修復 / マイクロホモロジー / DNA挿入 |
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| 研究概要 |
法医学において身元不詳死体の年齢推定は重要な鑑定項目の1つである。しかし、DNA解析からのアプローチは年齢依存的に生じる点変異が解明されていないこともあり，現時点では困難な状況である。本研究課題では、進化の過程で染色体DNA上に挿入されたミトコンドリアDNA（mtDNA）配列（NUMTS; nuclear insertions of mitochondrial sequences）の生成機構（非相同末端連結修復）に着目して、酸化ストレス等時間依存的因子により世代内でもNUMTSが生じることを証明し、世代内NUMTSの選択的分析法を開発することで、DNA解析による法医年齢推定法の確立を目指している。
当該年度では、本研究計画に従い培養細胞を用いた世代内NUMTS生成系確立のため、遺伝子改変ヒトmtDNAを受容する mtDNA欠損細胞の作製を開始した。そのためまず、ミトコンドリア輸送シグナルをもつ制限酵素遺伝子をもつ発現誘導型プラスミドを構築した。現在、これを使いヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞及びヒト上皮細胞由来HeLa細胞のmtDNA欠損細胞の作製を行っている。遺伝子改変ヒトmtDNAの構築については、現在設計段階である。
一方、新たに染色体部位特異的切断によるDNA組込み系の構築を開始した。この方法では、染色体DNAに効率よく取り込まれるDNA断片（mtDNAを含む種々のDNA断片）の特徴を解明するために、ヒトゲノム上には存在しない制限酵素（I-SecI）の認識配列とマーカー遺伝子を染色体上に挿入した細胞株をFlp recombinase（FR）を用いて作製する。当該年度は、まずFR標的部位を染色体上に組み込んだSH-SY5Y細胞及びHeLa細胞を作製した。今後、この細胞を用いて部位特異的に染色体DNA切断を誘導し、非相同末端連結修復時に組み込まれるDNA断片の解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画に従い、遺伝子改変ヒトmtDNAを受容する mtDNA欠損細胞の作製を開始し、ミトコンドリア輸送シグナルをもつ制限酵素遺伝子を発現誘導可能なプラスミドを構築した。また、このプラスミドを使いSH-SY5Y細胞及びHeLa細胞のmtDNA欠損細胞の作製を実施している。遺伝子改変ヒトmtDNAの構築については、現在まだ設計段階であり、当初計画よりやや遅れている。しかし、本研究課題を迅速に遂行するため、新たに、染色体部位特異的切断によるDNA組込み系の構築に着手し、部位特異的に染色体DNA切断を誘導するためのモデル細胞として、FR標的部位を染色体上に組み込んだSH-SY5Y細胞及びHeLa細胞を作製した。今後、この染色体部位特異的切断によるDNA組込み系を用いて研究を進める予定であり、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、改変mtDNAを構築し、これを導入した細胞を作製する。即ち、世代内NUMTSと進化上のNUMTSとを区別するため、染色体DNAに挿入されたときのみに蛍光を発するように変異を入れた緑色蛍光蛋白質GFP遺伝子を持つヒト改変mtDNAを構築する。続いて、mtDNA欠損細胞のミトコンドリア内へ、エレクトロポレーション法等でヒト改変mtDNAを導入する。呼吸能の回復を指標にヒト改変mtDNA受容細胞を選択・単離する。さらに平成27年度に、ヒト改変mtDNA導入細胞に年齢依存的因子である酸化ストレスを負荷し（アニソマイシン処理）、染色体DNAに二本鎖切断を誘導する。二本鎖切断が修復された細胞からDNAを抽出し、Inverse PCRにより新たに生じたNUMTSの周辺領域の塩基配列を解析し、NUMTS挿入部位の特異性及び共通性を検討する。
一方、当該年度に作成したFR標的部位導入細胞（SH-SY5Y細胞及びHeLa細胞）を用いて染色体部位特異的切断のモデル系を構築し、部位特異的な世代内NUMTSの実験的生成を行う。このモデル系では、FR標的部位導入細胞中の染色体DNA上に制限酵素I-SceI切断部位及びマーカー遺伝子を挿入した細胞を作製する。この細胞にテトラサイクリンで誘導されるI-SceI遺伝子と共に、mtDNA断片または種々の塩基配列を持つDNA断片を導入する。テトラサイクリンによりI-SceIを発現誘導し染色体DNAを部位特異的に切断後、修復された（世代内NUMTS生成候補）細胞のDNAを解析し、新たなDNA挿入部位の特異性及び共通性を検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
申請時の計画では、改変したmtDNAを細胞内のミトコンドリアに再導入するために，遺伝子銃の使用を予定していた。そこで、平成25年度に遺伝子銃購入のための物品費を請求した。しかし、交付額だけでは遺伝子銃の購入が困難であり、本研究課題を遂行するために実験方法を変更する必要性が生じた。
また、変更した実験方法では電気化学的あるいは生物化学的手法を用いるため、研究期間を通して、継続的に試薬類が必要となる。従って、上記理由により生じた次年度使用額を試薬類購入のための物品費に充てる計画である。
次年度は、上記の変更した実験方法を用いて本研究課題の中心となる実験を実施する。そこで、上記理由により生じた次年度使用額と平成26年度に請求した助成金とを合わせて、試薬類購入のための物品費に使用する計画である。また、平成26年度に研究成果の一部を学会で発表する予定であり、旅費として使用する計画である。
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