iPS細胞とRNAiを用いた新規解析戦略の確立とそれを用いたHTT遺伝子機能探索

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670428
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
• 研究代表者: 北條 浩彦 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 神経薬理研究部, 室長 (60238722)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: RNAi / iPS細胞 / ハンチントン病 / ハンチンチン遺伝子 / アデノ随伴ウイルス

研究概要

ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン（HTT）遺伝子のノックアウトマウスは8.5日胚までに胚性致死となるが、そのHTT遺伝子の胚発生過程における役割や細胞内での機能については全くわかっていない。本研究は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）とRNAiノックダウン法を組合せた新しいアプローチによってHTT遺伝子の胚発生過程での役割や細胞内の機能についてその解明の突破口となる新規データの取得を目的とする。
本年度は、まずHTT遺伝子発現抑制のためのsiRNAの設計とそれに基づくshRNA発現ベクターの構築を行った。ヒトHTT遺伝子とマウスHtt遺伝子の共通配列をターゲットにsiRNAを設計し、それをヒトHeLa細胞に導入して誘導されるRNAiのノックダウン効果をRT-ｑPCR法によって解析した。そのスクリーニングの結果、強いノックダウン効果を示すsiRNAを決定することができた。次にそのsiRNAの配列を基にshRNAを設計しshRNA発現ベクターを構築した。上記と同様の手法により強いRNAiノックダウン効果が誘導されることを確認した。そして、その構築したshRNA発現ベクターを用いてアデノ随伴ウイルス（AAV）へのパッケージングを行った。iPS細胞に関してはその培養手法の指導を受け、iPS細胞培養に向けての準備を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究計画の重要なツールであるshRNA発現AAVを初年度に構築することができた。よって、ほぼ計画通りの達成となったと考える。

今後の研究の推進方策

研究は順調に進んでおり、来年度（H26年度）における研究計画の変更は考えていない。

研究成果

• [雑誌論文] Disease-causing allele-specific silencing by RNA interference. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hohjoh H.
  • 雑誌名: Pharmaceuticals 巻: 6 ページ: 522-535
  • DOI: doi: 10.3390/ph6040522.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Specific inhibition of tumor cells by oncogenic EGFR specific silencing by RNA interference. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Chiyo T, Okada T, Hohjoh H.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e73214
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0073214.
  • 査読あり
• [雑誌論文] quitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) acts as a novel potentiator of cyclin-dependent kinases to enhance cell proliferation independently of its hydrolase activity. (2013)
  • 著者名/発表者名: , Uchida K, Hohjoh H, Wada K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 ページ: 12615-12626
  • DOI: doi: 10.1074/jbc.M112.435701.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a novel bone morphogenetic protein (BMP)-inducible transcript, BMP-inducible transcript-1, by utilizing the conserved BMP-responsive elements in the Id genes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shin M, Ohte S, Fukuda T, Sasanuma H, Yoneyama K, Kokabu S, Miyamoto A, Tsukamoto S, Hohjoh H, Jimi E, Katagiri T.
  • 雑誌名: J Bone Miner Metab. 巻: 31 ページ: 34-43
  • DOI: doi: 10.1007/s00774-012-0381-1.
  • 査読あり
• [雑誌論文] RNA expression during neuronal differentiation of human teratocarcinoma NTera2D1 and mouse embryonic carcinoma P19 cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hohjoh H.
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: 936 ページ: 257-269
• [学会発表] 野生型α-シヌクレイン過剰発現に対する遺伝子発現量補正型RNAi誘導法の確立と有効性評価 (2013)
  • 著者名/発表者名: 高橋理貴、鈴木マリ、藤掛伸宏、村田美穂、和田圭司、永井義隆、北條浩彦
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会大会
  • 発表場所: 神戸国際展示場(神戸)
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] A corrective gene silencing by RNA interference to control over-expressed SNCA. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Suzuki M, Fujikake N, Murata M, Wada K, Nagai Y, and Hohjoh H.
  • 学会等名: 63rd Annual Meeting of the American Society of Human Genetics
  • 発表場所: Boston Convention & Exhibition Center, Boston, MA, USA
  • 年月日: 20131022-20131026
• [学会発表] 進行性骨化性線維異形成症のiPS細胞を用いたアレル特異的RNAi(ASP-RNAi)と薬剤スクリーニング
  • 著者名/発表者名: 古谷博和、菅原三和、渡邊暁博、荒畑創、笹ヶ迫直一、藤井直樹、 高橋理貴、北條浩彦、江良択実
  • 学会等名: 第54回日本神経学会学術大会総会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム(東京)
• [図書] 原理からよくわかるリアルタイムPCR完全実験ガイド(編集：北條浩彦) (2013)
  • 著者名/発表者名: 北條浩彦
  • 総ページ数: 34
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 原理からよくわかるリアルタイムPCR完全実験ガイド(編集：北條浩彦) (2013)
  • 著者名/発表者名: 高橋理貴、北條浩彦
  • 総ページ数: 15
  • 出版者: 羊土社