| 研究課題/領域番号 |
25670454
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| 研究機関 | 独立行政法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
宮田 敏行 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (90183970)
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| 研究分担者 |
坂野 史明 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (00373514)
田嶌 優子 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (10423104) [辞退]
丸山 慶子 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 流動研究員 (30712624)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 血管内皮細胞 / 遺伝子発現 / トロンボモジュリン / プロテイン C 受容体 / マウス / トランスクリプトーム |
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| 研究実績の概要 |
血管内皮細胞には動静脈や組織部位による不均一性が指摘されているが、その機能的意義や疾患との関係についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、血管内皮細胞に発現する２つの抗凝固蛋白質、トロンボモジュリン（TM）とプロテインC受容体（EPCR）に着目し、これらを発現する細胞を異なる蛍光色素で可視化すると共に、細胞内で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を実施可能なTM-BacTRAPマウス（EGFP-L10aを発現）およびEPCR-BacTRAPマウス（mCherry-L10aを発現）を作製した。2種類のマウスの心臓および肺でのEGFPおよびmCherryとL10a融合タンパク質の発現をウエスタンブロットにて確認した。融合タンパクの発現が確認できた系統のマウスを用い、EGFPもしくはmCherry抗体を用いた免疫沈降を行い、心臓および肺から翻訳中のRNAを抽出した。抽出したRNAを用いて、目的分子のコピー数濃度を直接算出できるデジタルPCRを行い、EGFP、mCherry、TMおよびEPCRの発現量を確認した。その結果、予想に反して、EGFPおよびmCherryの発現量が少ないことが分かった。さらに、TM、EPCR発現細胞での翻訳中RNAの網羅的解析を行うために、マイクロアレイ解析を実施した。免疫沈降前(組織全体)に比べて、免疫沈降後サンプルでの内皮細胞特異的マーカー発現は約2-3倍しか増加していなかった。組織学的にEGFPおよびmCherry発現細胞を観察するため、免疫組織化学染色を試みたが、陽性染色像を確認することができなかった。今回作製したBacTRAPマウスはEGFPおよびmCherryの発現量が予想に反して低かったため、詳細な解析は困難であると判断した。
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