慢性皮膚粘膜カンジダ症の疾患モデルマウスの作成と治療法の確立

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670477
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 岡田 賢 広島大学, 大学病院, 助教 (80457241)
• 研究分担者: 津村 弥来 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 研究員 (80646274)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: STAT1 / CMCD / ノックインマウス / 治療

研究概要

1) ヒストンデアセチラーゼ阻害薬（HDACi）の効果の検証
HDACiが慢性皮膚粘膜カンジダ症患者の治療薬として利用可能という作業仮説のもと実験を行った。患者由来のEBV不死化B細胞（EBV-B細胞）を用いて、IFN-g刺激下でのSTAT1のリン酸化、DNA結合能を、HDACi処理の有無に分けて検討した。HDACi処理下でIFN-g刺激によるSTAT1のリン酸化の増強、GAS配列への結合能の増強を認めた。これは従来認めていた”HDACiによるSTAT1転写活性の抑制”と矛盾した結果であった。次に、STAT1欠損細胞株（U3C細胞）に野生型または変異STAT1を導入した細胞を用いて、同様の実験を行った。STAT1を強制発現したU3C細胞においても、HDACi処理下でのIFN-g刺激によるSTAT1のリン酸化の増強、GAS配列への結合能の増強を認めた。一連の結果より、HDACiは患者の治療薬として不適切と考えた。研究計画申請時に我々が提示した”HDACiによるSTAT1転写活性能の抑制”は、”IFN-g刺激によるGAS転写活性能をレポーターアッセイで検討した実験”でのみ認められ、”HDACiのSTAT1への直接作用”というよりも、”HDACiによるレポーターアッセイ実験系自体への影響”と考えられ、レポーターアッセイは薬剤の効果判定に不適切と判断した。同様の実験系で、次の候補薬であるSAMe（S-adenosylmethionine）を検討した。興味深いことにSAMe存在下では、IFN-g刺激によるSTAT1リン酸化、DNA結合能の若干の低下を認め、STAT1の過剰なシグナル伝達を抑制できる可能性が示唆された。
2) R274Q 変異ノックインマウスの作成
計画は概ね順調に進行しており、ターゲットベクターの作成、ESクローンの樹立は終了、キメラマウス作成段階にある。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1) 研究を通じてHDACiが治療薬として使用できないこと分かり、研究計画を修正した。次の候補薬であるメチル基供与体であるSAMe（STAT1機能獲得性変異を有する患者で有効という論文が１報存在）を検討したところ、STAT1シグナル伝達への弱い抑制効果を示すという興味深い結果を得た。一連の検討から今回確立した実験系は、治療薬のスクリーニングに利用可能と考えられ、今後に治療法を開発していく上で有用な進展と考えた。
２）ノックインマウスの作成は、ターゲットベクターの作成、ESクローンの樹立が終了し、キメラマウスの作成を行っている状況で、当初の計画通り順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

STAT1変異ノックインマウスの作成
現在キメラマウスを作成段階であり、本年度中にSTAT1機能獲得性変異を導入したノックインマウスを作成する。作成したノックインマウスは、最初に表現形の確認を行う。表現形が得られた場合、病態解析に役立てるとともに、治療薬の効果判定を行うためのモデルマウスとして利用する。
今回確立した実験系を用いた他の治療薬候補の評価
フルダラビンを次の治療薬候補として考えている。フルダラビンの持つSTAT1シグナル伝達抑制効果について、前年度に確立した実験手法を用いたin vitroの検討を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Simple diagnosis of STAT1 gain-of-function alleles in patients with chronic mucocutaneous candidiasis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizoguchi Y, Tsumura M, Okada S, Hirata O, Minegishi S, Imai K, Hyakuna N, Muramatsu H, Kojima S, Ozaki Y, Imai T, Takeda S, Okazaki T, Ito T, Yasunaga S, Takihara Y, Bryant VL, Kong XF, Cypowyj S, Boisson-Dupuis S, Puel A, Casanova JL, Morio T, Kobayashi M.
  • 雑誌名: J Leukoc Biol. 巻: 95 ページ: 667-76
  • DOI: 10.1038/jid.2013.480
  • 査読あり
• [雑誌論文] IL-17 T Cells' Defective Differentiation In Vitro Despite Normal Range Ex Vivo in Chronic Mucocutaneous Candidiasis Due to STAT1 Mutation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mekki N, Ben-Mustapha I, Liu L, Boussofara L, Okada S, Cypowyj S, Ghariani N, Saidi W, Denguezli M, Casanova JL, Puel A, Barbouche MR.
  • 雑誌名: J Invest Dermatol. 巻: 134 ページ: 1155-7
  • DOI: 10.1038/jid.2013.480
  • 査読あり
• [雑誌論文] New and recurrent gain-of-function STAT1 mutations in patients with chronic mucocutaneous candidiasis from Eastern and Central Europe. (2013)
  • 著者名/発表者名: Soltesz B, Toth B, Shabashova N, Bondarenko A, Okada S, Cypowyj S, Abhyankar A, Csorba G, Tasko S, Sarkadi AK, Mehes L, Rozsival P, Neumann D, Chernyshova L, Tulassay Z, Puel A, Casanova JL, Sediva A, Litzman J, Marodi L.
  • 雑誌名: J Med Genet. 巻: 50 ページ: 567-78
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2013-101570
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heterozygosity for the Y701C STAT1 mutation in a multiplex kindred with multifocal osteomyelitis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirata O, Okada S, Tsumura M, Kagawa R, Miki M, Kawaguchi H, Nakamura K, Boisson-Dupuis S, Casanova JL, Takihara Y, Kobayashi M.
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 98 ページ: 1461-9
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.083741
  • 査読あり
• [雑誌論文] Partial IFN-γR2 deficiency is due to protein misfolding and can be rescued by inhibitors of glycosylation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Moncada-Velez M, Martinez-Barricarte R, Bogunovic D, Kong XF, Blancas-Galicia L, Tirpan C, Aksu G, Vincent QB, Boisson B, Itan Y, Ramirez-Alejo N, Okada S, et. al.
  • 雑誌名: Blood 巻: 122 ページ: 2390-401
  • DOI: 10.1182/blood-2013-01-480814
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel homozygous p.R1105X mutation of the AP4E1 gene in twins with hereditary spastic paraplegia and mycobacterial disease. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kong XF, Bousfiha A, Rouissi A, Itan Y, Abhyankar A, Bryant V, Okada S, Ailal F, Bustamante J, Casanova JL, Hirst J, Boisson-Dupuis S.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e58286
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0058286
  • 査読あり
• [雑誌論文] Age-dependent association between pulmonary tuberculosis and common TOX variants in the 8q12-13 linkage region. (2013)
  • 著者名/発表者名: Grant AV, El Baghdadi J, Sabri A, El Azbaoui S, Alaoui-Tahiri K, Abderrahmani Rhorfi I, Gharbaoui Y, Abid A, Benkirane M, Raharimanga V, Richard V, Orlova M, Boland A, Migaud M, Okada S, et al.
  • 雑誌名: Am J Hum Genet. 巻: 92 ページ: 407-14
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.01.013
  • 査読あり
• [学会発表] 新生児期の好中球減少症 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡田 賢
  • 学会等名: 日本産婦人科・新生児血液学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20140613-20140614
• [学会発表] STAT1異常による原発性免疫不全症 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡田 賢
  • 学会等名: 日本小児科学会
  • 発表場所: 広島
  • 年月日: 20130419-20130421