| 研究課題/領域番号 |
25670589
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
池田 一雄 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80275247)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 肝細胞 / 肝星細胞 / iPS細胞 |
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| 研究概要 |
本研究において、ラット肝臓、マウス肝臓を界面活性剤（0.5％ＳＤＳ）を含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓の微細形態を保持した［肝臓基質］を作製し、この肝臓基質に、iPS細胞由来ヒト肝細胞を還流によって移植し、生着させ肝臓基質を再細胞化することを目標に本年度は、以下の２点について検討を行った。
１）［肝細胞基質］作製：ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系（体外循環系）で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5％ＳＤＳを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製することができた。
２）iPS細胞から肝細胞への分化誘導の効率化：ヒトiPS細胞を、ActivinAを100ng/mlとなるよう添加したRPMI Medium 1690+B27 supplement中で、37℃、5%CO2条件下で5日間培養した。次に、20ng/ml BMP4と10ng/ml FGF2を添加したRPMI medium 1690+B27 supplementで37℃、5%CO2、4%O2条件下で5日間培養し、増殖因子を20ng/ml HGFに変更し、引き続き低酸素条件下で5日間培養した。その後、20ng/ml OSMとHCM SingleQuotsを添加したHepatocyte Basal Mediumで37℃、5%CO2条件下で5日間培養することにより、肝細胞へと分化誘導させた。さらに、ウイルスベクターによる遺伝子導入やフィーダー細胞として肝星細胞を利用する等の工夫を加え、効率化を検討した。ウエスタンブロットや免疫組織化学によって、AFPやALBの発現を調べた結果、約50％程度の細胞が肝細胞へと分化誘導させることが可能となっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要で記載したとおり、ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系（体外循環系）で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5％ＳＤＳを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
肝臓基質へのヒト細胞注入に関しては、iPS細胞由来肝細胞を使用する当初の予定を進めていく前に、HEPG2,LX2などのヒト細胞株を用いて研究を進めることとする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２６年度は、肝臓基質へのヒト細胞注入に関してiPS細胞由来肝細胞を使用する当初の予定を進めていく前に、HEPG2,LX2などのヒト細胞株を用いて研究を進める実験を追加することとした。
平成２６年度は、肝臓基質へのヒト細胞注入に関してiPS細胞由来肝細胞を使用する当初の予定を進めていく前に、HEPG2,LX2などのヒト細胞株を用いて研究を進める実験を追加することとした。上皮系細胞と肝葉系細胞の相互作用による肝臓機能がどのように変化するのかを調べることに主眼を置いて実験を進める。
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