「腎結石の自然消失」という新しい概念の樹立と溶解療法の開発への応用

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670685
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 岡田 淳志 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (70444966)
• 研究分担者: 郡 健二郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30122047) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40326153) ; 廣瀬 泰彦 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 臨床研究医 (60381894) ; 広瀬 真仁 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70529172) ; 新美 和寛 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70551274) ; 濱本 周造 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (80551267)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 尿路結石 / op/op / マクロファージ / マイクロアレイ

研究概要

+/+およびop/opマウスにグリオキシル酸80mg/kgを連日腹腔内投与し、day0,3,6,9,12にて腎組織を採取してRNeasy mini kit(Qiagen)を用いてRNAを精製し、3’IVT Express kitにてaRNAを合成後、Mouse Genome 430 2.0 Arrayへのhybridizationを行った。DataはGeneSpring GX11.0を用いて解析した。
その結果、グリオキシル酸投与前のop/opマウスの腎組織は+/+と比べて、Gene Ontology解析において、抗原結合, 免疫複合体, 液性免疫反応, 貪食, 免疫炎症反応のdown-regulationを認めた。
結石形成期であるday3-6にかけて、op/opマウスでは血管内皮細胞の調整や炎症・細胞周期に係わる遺伝子群のup-regulationを認め、ケモカイン産生や顆粒球の活性化の促進やadenosine receptorの活性化に係わる遺伝子群のdown-regulationを認めた。
結石消失期であるday9-12にかけては、op/opマウスではB細胞やリンパ球を介した免疫機構に係わる遺伝子群のup-regulationを認め、また細胞増殖や細胞周期に係わる遺伝子群の down-regulationを認めた。
これらの結果から、op/opマウスの腎では、免疫機構の破綻によって炎症・細胞障害が促進され、結石形成の増加と消失の低下を生じた可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

実験計画に基づき、マイクロアレイ解析を行った。
現在は抽出された遺伝子発現を順次定量PCRなどの手段で確認している。

今後の研究の推進方策

●ヒト血液抽出Mφを用いた結晶貪食in vitroモデルの確立と貪食制御試験
(1)血液からのMφ分離と結晶貪食モデルの確立：腎結石患者及び健常者の採血を施行する。末梢血からマイクロビーズ用分離装置を用いてMφを分離培養する。また培養Mφにシュウ酸カルシウム1水和物(COM)結晶を添加し、結晶貪食率を測定する。(2)M-CSFおよび関連因子投与による結晶貪食能の変化についての解析：ヒト血液からの分離Mφに対し、ヒト組換え型M-CSF(hrM-CSF)およびI研究にて同定されたMφ関連因子で入手可能な物質を投与し、COM結晶貪食率の変化を観察する。研究に用いたMφからはRNA、蛋白を抽出し、定量PCR, Western blottingにて関連遺伝子発現の変化を確認する。最終的に、結石貪食率に有意な増加を認めた因子についてのみ、次段階の研究に採用する。
●動物を用いた腎結石防御 in vivoモデルの確立と制御因子の機能解析
(1)ラット・サル動物モデルの確立：ラットに対しシュウ酸前駆物質であるエチレングリコール(EG)を投与すると、腎シュウ酸カルシウム結石が形成される。この手法を応用して、サルにおいても腎結石形成モデルを確立する。腎結石形成量の定量は、動物用CT装置をレンタルして用いる。EG投与後、麻酔下に腎を採取し、Pizzolato染色・偏光顕微鏡観察により結石形成を確認する。Mφ関連因子の発現に関しては、摘出腎組織の免疫染色、ならびにWestern Blotting、および定量PCRによって確認する。さらに透過型電子顕微鏡を用いて、腎Mφが腎結石を貪食する像を捉える。(2)動物モデルに対する結石防御実験：EG投与と併行して、これまでの研究で選出したMφ制御因子を動物モデルに投与する。さらに投与薬剤による副作用を確認するため、血液を採取して肝・腎機能傷害を含めた確認を行う。

次年度の研究費の使用計画

本年度実施したマイクロアレイの結果、抽出された遺伝子群について、引き続き定量PCR、免疫染色・Western blotで確認する必要があるため。
定量PCRのためのTaqManプローブ、免疫染色・Westen blotの為の抗体、ならびにその試薬のための経費が必要である。

研究成果

• [雑誌論文] Long-term follow-up of nephrotoxicity in rats administered both melamine and cyanuric acid. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasui T, Kobayashi T, Okada A, Hamamoto S, Hirose M, Mizuno K, Kubota Y, Umemoto Y, Kawai N, Tozawa K, Gao B, Kohri K.
  • 雑誌名: BMC Res Notes. 巻: 7 ページ: 87
  • DOI: 10.1186/1756-0500-7-87.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficacy of retroperitoneal laparoscopic ureterolithotomy for the treatment of large proximal ureteric stones and its impact on renal function. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasui T, Okada A, Hamamoto S, Taguchi K, Ando R, Mizuno K, Itoh Y, Tozawa K, Hayashi Y, Kohri K.
  • 雑誌名: Springerplus. 巻: 2 ページ: 600
  • DOI: 10.1186/2193-1801-2-600.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa J, Okada A, Taguchi K, Fujii Y, Zuo L, Niimi K, Hamamoto S, Kubota Y, Umemoto Y, Itoh Y, Yasui T, Kawai N, Tozawa K, Kohri K.
  • 雑誌名: Urolithiasis. 巻: 42 ページ: 17-28
  • DOI: 10.1007/s00240-013-0612-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endoscopic combined intrarenal surgery for large calculi: simultaneous use of flexible ureteroscopy and mini-percutaneous nephrolithotomy overcomes the disadvantageous of percutaneous nephrolithotomy monotherapy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto S, Yasui T, Okada A, Taguchi K, Kawai N, Ando R, Mizuno K, Kubota Y, Kamiya H, Tozawa K, Kohri K.
  • 雑誌名: J Endourol. 巻: 28 ページ: 28-33
  • DOI: 10.1089/end.2013.0361.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of official technical training for urologists on the efficacy of shock wave lithotripsy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okada A, Yasui T, Taguchi K, Niimi K, Hirose Y, Hamamoto S, Ando R, Kubota Y, Umemoto Y, Tozawa K, Sasaki S, Hayashi Y, Kohri K.
  • 雑誌名: Urolithiasis. 巻: 41 ページ: 487-492
  • DOI: 10.1007/s00240-013-0586-3.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxygen nano-bubble water reduces calcium oxalate deposits and tubular cell injury in ethylene glycol-treated rat kidney. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirose Y, Yasui T, Taguchi K, Fujii Y, Niimi K, Hamamoto S, Okada A, Kubota Y, Kawai N, Itoh Y, Tozawa K, Sasaki S, Kohri K.
  • 雑誌名: Urolithiasis. 巻: 41 ページ: 279-294
  • DOI: 10.1007/s00240-013-0576-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A replication study for three nephrolithiasis loci at 5q35.3, 7p14.3 and 13q14.1 in the Japanese population. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasui T, Okada A, Urabe Y, Usami M, Mizuno K, Kubota Y, Tozawa K, Sasaki S, Higashi Y, Sato Y, Kubo M, Nakamura Y, Matsuda K, Kohri K.
  • 雑誌名: J Hum Genet. 巻: 58 ページ: 588-593
  • DOI: 10.1038/jhg.2013.59.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of adiponectin on kidney crystal formation in metabolic syndrome model mice via inhibition of inflammation and apoptosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujii Y, Okada A, Yasui T, Niimi K, Hamamoto S, Hirose M, Kubota Y, Tozawa K, Hayashi Y, Kohri K.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e61343
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0061343.
  • 査読あり
• [学会発表] Effect of an ultrasonic targeting method for kidney and proximal ureter stones on the success rate of shock wave lithotripsy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okada Atsushi, Taguchi Kazumi, Ando Ryosuke, Umemoto Yukihiro, Itoh Yasunori, Yasui Takahiro, Sasaki Shoichi, Kohri Kenjiro
  • 学会等名: American Urological Association Annual Meeting 2013
  • 発表場所: San Diego Convention Center( San Diego, USA)
  • 年月日: 20130504-20130508
• [学会発表] 尿路結石の成因からみた予防法 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡田 淳志、郡 健二郎
  • 学会等名: 第101回日本泌尿器科学会総会
  • 発表場所: さっぽろ芸術文化の館（札幌）
  • 年月日: 20130425-20130428
  • 招待講演
• [学会発表] 腎結石の溶解療法の開発に向けたマクロファージによるシュウ酸カルシウム結晶の貪食機序の解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡田 淳志、安井 孝周、田口 和己、藤井 泰普、濵本 周造、伊藤 恭典、戸澤 啓一、郡 健二郎
  • 学会等名: 第101回日本泌尿器科学会総会
  • 発表場所: さっぽろ芸術文化の館（札幌）
  • 年月日: 20130425-20130428
• [学会発表] R2-U1結石に対するESWL成功率における超音波照準の有用性 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡田 淳志、飯田 啓太郎、田口 和己、藤井 泰普、岩月 正一郎、内木 拓、井村 誠、神沢 英幸、広瀬 真仁、梅本 幸裕、河合 憲康、佐々木 昌一、郡 健二郎
  • 学会等名: 第101回日本泌尿器科学会総会
  • 発表場所: さっぽろ芸術文化の館（札幌）
  • 年月日: 20130425-20130428