研究課題
挑戦的萌芽研究
内耳の発生および構造は複雑で、内耳研究に取り組むハードルを高める要因である。本研究では、内耳の発生を試験管内で再現・模倣し、それらの細胞が形態形成を行うプロセスを解明すべく、内耳幹細胞（耳胞細胞otic vesicle cells：OVC）を用いたin vitro内耳発生モデルの構築を目的とした。まず初年度（平成25年度）は、耳胞細胞（OVC）の単離・培養に着手した。マウス胎児からマイクロダイセクションにより耳胞細胞（OVC）を単離し、培養条件を検討後、増殖活性の高いcloneを選択し、長期間培養可能な株化細胞（OVC1）を樹立した。遺伝子解析の結果、OVC1は、神経幹細胞のマーカーを発現し、内耳内成熟細胞のマーカーの発現は認められない未熟な細胞であることが明らかとなった。また、内耳細胞の中でも特に難聴に関わる内耳有毛細胞に着目し、特異的なマーカー遺伝子（Math1）のプロモーター活性により蛍光タンパク質を発現可能なplasmid constructを作成した。この遺伝子をOCV1細胞へtransfectionし、薬剤耐性細胞（M-OVC1）を樹立した。続けて、このM-OVC1細胞をin vitro培養系で各種Wntを添加培養した結果、ある種のWntが増殖活性を抑制し、分化を誘導することが明らかとなった。次年度（平成26年度）、OVC1細胞を用いた内耳細胞への分化プロセスをより精査し、さらに、多細胞との共培養による分化誘導の効率化およびWntシグナルの意義を検証する。
2: おおむね順調に進展している
研究計画に基づき、期待した実験成果が得られており、学会発表および論文発表での成果報告を行っているため。
次年度（平成26年度）では、M-OVC1とエフェクター細胞（EFC）の共培養により内耳初期形成モデルを構築し（in vitro内耳発生システム）、さらに、Wntシグナルならびに細胞間ネットワークの影響を細胞／組織レベルで、時間的・空間的に可視化・解析することで、内耳形成メカニズムを解明する。具体的には、内耳の発生を模倣するに当たって、M-OVC1と、ある種のエフェクター細胞（EFC）を混合培養することで、各種Wntシグナルの影響を解析する。また、樹立したM-OVC1細胞およびエフェクター細胞（EFC）を蛍光標識することで分別可能としたこれらの細胞を混合培養し、複雑な内耳初期発生の影響を精査する。さらに、内耳細胞分化・発生におけるWntの影響を調べるため、Wntをin vitro培養システムに取り入れることで、内耳発生への影響を精査する。FACSあるいはレーザーマイクロダイセクションにより細胞分離・分取し、リアルタイムPCR、DNA arrayなどを用いた遺伝子解析を行い、発生した内耳細胞間のキャラクタリゼーション、内耳形成における分化プロセスを解析する。
本研究計画の後半（平成26年度）において、内耳発生に関わる遺伝子変化を詳細に解析する目的で、DNA array等、受託研究費および抗体などの消耗品購入が予想された。それらは高額になると考えられたため、本研究計画の前半（平成25年度）の研究費用をできるだけ抑えるように腐心した。平成25年度は、細胞材料の準備やその維持のために、培養液やプラスチックシャーレ等の消耗品購入費用が生じたが、計画的かつ必要最小限の量を購入することで、繰越金を捻出した。本年度（平成26年度）、DNA arrayなどの受託研究費が発生することも鑑み、繰越金を使用して更なる解析を進める。その際、本研究計画の前半に購入した消耗品を継続して使用することや、実験に必要な物品を計画的に追加購入することで、研究を遂行する。
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