予防、治療を目指したヒト疾患特異的iPS細胞を用いた骨系統疾患解析に関する研究

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25670856
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 別所 和久 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90229138)
• 研究分担者: 小山 典昭 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 医員 (30599931) ; 中尾 一祐 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40599932) ; 高橋 克 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90314202)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 疾患特異的iPS細胞 / GNAS遺伝子変異 / 線維性異形成症

研究概要

医の倫理委員会の承認を受け、京大病院ですでに研究がスタートしている「ヒト疾患特異的iPS細胞の作成とそれを用いた疾患解析に関する研究」のプロジェクトの一つとして本研究に取り組んだ。研究参加の同意の得られた線維性異形成症（Fibrous Dysplasia of bone: FD）患者３人の病変部の手術検体より細胞を採取した。CiRA（京都大学iPS細胞研究所）において、レトロウイルスベクターを用いて4遺伝子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)を導入することによりiPS細胞の作成を試みた。 FD病変部位において、GNAS遺伝子変異のある変異細胞とない健常な細胞とがモザイク状態で分布していると報告されているため、1人目の患者さんにおいて、手術検体の病理組織切片の病変部から抽出したgenomic DNA において201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。ダイレクトシークエンスにて201番目のArgの遺伝子変異の確認することができた。そこで、12クローンのiPS細胞を作成し、病変採取部位から樹立したiPS細胞よりgenomic DNAを抽出し、ダイレクトシークエンスにて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。12クローンすべてが正常型で、変異型のiPS細胞は認めなかった。そこで、2人目の患者さんからは、樹立するiPS細胞クローンの数を増やすこととし、61クローンのiPS細胞を樹立した。同様に変異の有無を確認したが、201番目のArgの遺伝子変異を有するiPS細胞株を得ることはできなかった。3人目の患者さんにおいては、手術検体と手術検体より得られたiPS細胞作製するための培養細胞からそれぞれgenomic DNA抽出し検討を行っているところだ。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

現在までのところ、研究参加の同意の得られた線維性異形成症（Fibrous Dysplasia of bone: FD）患者３人から、多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っていない。以後の研究に必要なGNAS遺伝子に変異のないコントロール用のiPS細胞は多数確保することができたが、疾患特異的iPS細胞の樹立できていないため、以降の実験にすすむことができない状況である。早急に疾患特異的iPS細胞の樹立に努める。

今後の研究の推進方策

現在までのところ、病変組織より多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っていない。原因として考えられることとしては、１)病変部では、変異細胞とない健常な細胞とがモザイク状態で分布しているとされるが、変異細胞の割合が健常細胞に比較して著しく少ない。
２）病変部の手術検体より細胞を採取する際に、変異細胞と健常細胞の増殖スピード著しく異なり、結果としてiPS細胞をつくるための細胞の中の変異細胞の割合が著しく少ない。３）変異細胞では、健常細胞と比較し、iPS化の効率が著しく悪い。
などの可能性が考えれれる。そこで、病変部、手術検体より得られたiPS細胞作製するための培養細胞における変異細胞の割合を算出するために、それぞれのgenomic PCRのfragmentをplasmid vectorにサブクローンすることによりクローン化する。５０－１００クローンをシークエンスし、そこで検出される変異型の割合から、病変部、iPS細胞作製するための培養細胞それぞれの変異細胞の割合を算出する。病変部と培養細胞の変異細胞の割合がほぼ同じであれば、培養細胞の作成方法に問題ないことになるため、もともとの変異細胞の割合の５－１０倍程度のiPS細胞クローン（５％であれば、２５－５０クローン程度）を作成数の目安とする。培養細胞で変異細胞の割合が下がるようであれば、培養方法を得るための方法を見直し、変異細胞の得られやすいような培養細胞の作成方法を検討する。

次年度の研究費の使用計画

現在までのところ、研究参加の同意の得られた線維性異形成症（Fibrous Dysplasia of bone: FD）患者３人から、多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っておらず、研究の進行に遅れがでている。そのため、予定していた研究費を使用する必要がなかったため。
現在遅れがでている研究を期間内に完了するために、今年度に研究の進行に合わせて使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Bone regeneration of rat calvarial defect by magnesium calcium phosphate gelatin scaffolds with or without bone morphogenetic protein-2 (2014)
  • 著者名/発表者名: Hussain, A., Takahashi, K., Sonobe, J., Bamba, M., Tabata, Y and Bessho, K.
  • 雑誌名: J Maxillofac Oral Surg. 巻: 13 ページ: 75-77
  • DOI: 10.1007/s12663-013-0478-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human Induced Pluripotent Stem Cells Differentiated into Chondrogenic Lineage Via Generation of Mesenchymal Progenitor Cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Koyama N, Miura M, Nakao K, Kondo E, Fujii T, Taura D, Kanamoto N, Sone M, Yasoda A, Arai H, Bessho K, Nakao K.
  • 雑誌名: Stem Cells Dev 巻: 22 ページ: 102-113
  • DOI: 10.1089/scd.2012.0127
  • 査読あり
• [雑誌論文] Aldehyded dextran and ε-poly(l-lysine) hydrogel as non-viral gene carrier. (2013)
  • 著者名/発表者名: Togo Y, Takahashi K, Saito K, Kiso H, Huang B, Tsukamoto H, Hyon SH, Bessho K.
  • 雑誌名: Stem Cell Int 巻: 2013 ページ: 634379
  • DOI: 10.1155/2013/634379
  • 査読あり
• [雑誌論文] Risk factors and indices of osteomyelitis of the jaw in osteoporosis patients: Results from a hospital-based cohort study in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki, T., Yamori, M., Tanaka, S., Yamamoto, K., Sumi, E., Nishimoto, M., Asai, K., Takahashi, K., Nakayama, T. and Bessho, K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 ページ: e79376
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0079376
  • 査読あり
• [雑誌論文] Methotrexate-associated lymphoproliferative disorder mimicking pyocyanic ecthyma gangrenosum in a patient with rheumatoid arthritis (2013)
  • 著者名/発表者名: Inuzuka K, Endo Y, Kato M, Fujisawa A, Tanioka M, Kabashima K, Tsukamoto H, Sonobe J, Bessho K, Miyachi Y.
  • 雑誌名: Eur J Dermatol. 巻: 23 ページ: 418-419
  • DOI: 10.1684/ejd.2013.2044
  • 査読あり
• [雑誌論文] The effects of C-type natriuretic peptide on craniofacial skeletogenesis (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakao K, Okubo Y, Yasoda A, Koyama N, Osawa K, Isobe Y, Kondo E, Fujii T, Miura M, Nakao K, Bessho K.
  • 雑誌名: J Dent Res. 巻: 92 ページ: 58-64
  • DOI: 10.1177/0022034512466413
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mastication and risk for diabetes in a Japanese population: a cross-sectional study (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki, T., Yamori, M., Asai, K., Nakano-Araki, I., Yamaguchi, A., Takahashi, K., Sekine, A., Matsuda, F., Kosugi, S., Nakayama, T. and Bessho, K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 ページ: e64113
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0064113
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phenotypes of CCAAT/enhancer-binding protein beta deficiency: hyperdontia and elongated coronoid process (2013)
  • 著者名/発表者名: Huang B, Takahashi K, Sakata-Goto,T, Kiso,H, Togo,Y, Saito,K, Tsukamoto,H, Sugai,M, Akira S, Shimizu A, Bessho,K
  • 雑誌名: Oral Dis 巻: 19 ページ: 144-150
  • DOI: 10.1111/j.1601-0825.2012.01963.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Assessing anteroposterior basal bone discrepancy with the Dental Aesthetic Index (2013)
  • 著者名/発表者名: Huang B, Takahashi K, Yamazaki T, Saito K, Yamori M, Asai K, Yoshikawa Y, Kamioka H, Yamashiro T, Bessho K,.
  • 雑誌名: Angle Orthod, 巻: 83 ページ: 527-532
  • DOI: 10.2319/050312-369.1
  • 査読あり
• [雑誌論文] A pragmatic method for electronic medical record-based observational studies: developing an electronic medical records retrieval system for clinical research. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto K, Sumi E, Yamazaki T, Asai K, Yamori M, Teramukai S, Bessho K, Yokode M, Fukushima M.
  • 雑誌名: BMJ Open 巻: 2 ページ: e001622
  • DOI: 10.1136/bmjopen-2012-001622
  • 査読あり
• [学会発表] ヒトiPS細胞を用いて間葉系前駆細胞を介した骨芽細胞への分化誘導 (2013)
  • 著者名/発表者名: 磯部悠、小山典昭、池野正幸、中尾一祐、高橋克、別所和久
  • 学会等名: 第５8回 日本口腔外科学会総会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20131011-20131013
• [学会発表] ヒトiPS細胞は間葉系前駆細胞を介して軟骨細胞へ分化する (2013)
  • 著者名/発表者名: 小山 典昭, 三浦 晶子, 中尾 一祐, 上田 依利子, 山下 唯, 近藤 絵里, 藤井 寿人, 田浦 大輔, 金本 巨哲, 曽根 正勝, 八十田 明宏, 荒井 宏司, 別所 和久, 中尾 一和
  • 学会等名: 2013年国際骨代謝学会・日本骨代謝学会 第2回合同国際会議
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20130528-20130601
• [備考] 京都大学医学部附属病院歯科口腔外科
  • URL: http://kuhp.kyoto-u.ac.jp/~oral_surg/Oral_Surg_index.html
• [備考] 京都大学大学院医学研究科・医学部
  • URL: http://www.med.kyoto-u.ac.jp/organization-staff/research/doctoral_course/r-057/