研究課題
申請者らはこれまでに、有害環境化学物質・新世代ビスフェノール・AFが、エストロゲン受容体α型（ERα）に非常に強く結合し、活性化するアゴニストとして働くが、β型には活性を阻害するアンタゴニストであるという意外な新発見をした。さらに最近、ERαの活性は、ビスフェノールＡにより、名前は似るが全く別の受容体であるエストロゲン関連受容体γ型が存在すると約20倍も増強される新奇な現象を見出した。これまでの緻密な転写活性試験と立体構造解析に基づき、「DNA上のタンデムなER応答配列に複数の核内受容体が結合し、互いの転写因子複合体に影響することによる『転写協同制御』がビスフェノール低用量効果の本質である」と考えられた。そこで本研究では、これら分子メカニズムの解明を目的とする。そのために、3年計画の第2年度となる本年度は、まず前年度に構築したERαとERβの細胞内局在解析実験のためのEGFP融合発現プラスミドを用いて、CV1細胞で発現部位解析を実施した。いずれもリガンドであるビスフェノールAFの添加の有無にかかわらず、核に局在していた。細胞の種類や観察する時期特異的な局在の変化が考えられるため、今後引き続き検討を行い、リガンド依存的に局在が変化するのかを検討する。さらに、前年度に設計したゲルシフトアッセイのための受容体応答配列に従って核酸を合成し、放射ラベルプローブを用いた明敏なゲルシフトアッセイ系の構築に成功した。ところで、一般にレポーター試験には応答配列が3回繰り返された配列を用いる。そこで、放射比活性を指標に標識されたプローブの分子数が同じになるようにコントロールして1回繰り返しと3回繰り返し配列でエストロゲン関連受容体γ型の結合の程度を比較した。その結果1回のみの応答配列より3回繰り返し応答配列の方が、受容体が結合しやすいと考えられた。こうして計画した研究を順調に進展させた。
2: おおむね順調に進展している
3年計画の第２年度となった本研究は、初年度に引き続き概ね計画通り順調に進展している。初年度にプローブの設計を行ったゲルシフトアッセイについては、予定通り申請者が既に構築済みのウサギ網状赤血球発現系を用いて全長を発現することにより核内受容体を調製して実施した。エストロゲン受容体α型およびβ型、エストロゲン関連受容体α型、β型、γ型の全ての受容体を発現できた。プローブはP32による高効率の放射標識を行い、アッセイに供出した。エストロゲン受容体とエストロゲン関連受容体の応答特性が識別出来た。さらに、これまでに作製した受容体をタンデムに並べることによる強制ダイマー発現プラスミドERα―ERα、ERα-ERRα、ERRα―ERα、ERRα―ERRαの全てが、応答配列にモノマーを発現した場合と同様に結合していることが示された。こうして、エストロゲン関連受容体によるエストロゲン受容体の活性増強機構を考える上で、重要な知見を得られた。前年度に実行中であったCaspase7とのプロモーター部位配列のクローニングは、エストロゲン応答配列となる繰り返し配列により困難であったが、PCR酵素を検討ことにより最終的には目的領域を増幅できクローンの取得に成就した。レポーター試験では、人工的な応答配列同様に活性が見られた。しかし、エストロゲン受容体とエストロゲン関連受容体の共存による活性増強は見られなかった。また、本年度に予定通りERβの結晶化を実施したが、現時点では結晶は得られなかった。唯一、エストロゲン受容体α型およびエストロゲン関連受容体γ型の同時発現系における転写因子複合体の単離実験の実施が遅れている。これは実施計画を再検討しにより、より確実に複合体を取得できる方法を考慮しているためである。
今後は、平成25年度に作製が終了し、平成26年度にCV1細胞を用いて試験した緑色蛍光タンパク質融合エストロゲン受容体α型およびβ型の新世代ビスフェノール依存的細胞内局在解析を、細胞の種類を変えて実施する。さらに、エストロゲン関連受容体γ型についても、各種点変異体を作製済みであり、これらの細胞内局在も解析する。前年度に行ったエストロゲン受容体α型の変異体を用いたレポーター試験により、新世代ビスフェノールが部分的なアゴニスト（パーシャルアゴニスト）として応答する可能性が示されたため、同様の変異をβ型に導入してα型様の応答を示すかレポーターアッセイをする。こうしてエストロゲン受容体α型とβ型に対する新世代ビスフェノールの応答性の差異の分子メカニズム解明に迫る。さらに、エストロゲン受容体とエストロゲン関連受容体の共存による活性増強機構を解明するため、DNA上の応答配列の影響を解析することを目的に、活性増強が見られる配列と見られない配列の比較解析を実施する。そのためのDNA応答配列を持つレポーター試験系を現在構築中である。また、構造解析についてはエストロゲン関連受容体γ型に注目し、各種変異受容体とリガンドとの結合体の結晶作成およびデータ解析を実施中である。そして、エストロゲン受容体β型のリガンド結合部位を大腸菌を用いて発現し、新生代ビスフェノールとの結合体の結晶作製に取り組む。既に発現系の最適化は終了している。現時点では結晶が得られておらず、引き継き結晶作成を継続すると共に、統合科学計算システムMOEを用いたドッキングシミュレーションに取り組む。こうして、エストロゲン関連受容体γ型の活性増強機構に迫る。
本研究は順調に計画通りに進んだ。しかしながら次年度使用金額が生じた。この理由の１つは、単純に3月末に注文した試薬の国内在庫が無く、取り寄せに時間がかかったため、3月中の納品ができなかったためである。また、研究状況の進展状況により、保存可能期間が短いために本年度に購入予定であった試薬のいくつかを次年度に購入することにしたものや、逆に次年度に購入する予定であったが本年度に購入して研究を加速させたものがあった。そのために差し引きとして、次年度使用額が生じた。こうした理由につき、次年度使用額が生じたが、本研究は順調に進んでおり、特に問題は生じていない。
3月に注文した試薬で、国内在庫が無く取り寄せに時間がかかったものについては、4月中の納品が見込まれているため、それの支払いに使用する。また、研究状況の進展により前年度に購入する予定であったが、次年度に購入することにした試薬については、これらを購入する。このように、助成金は当初計画と大きな変更は無く、問題なく使用予定である。
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Peptide Science 2014
巻: - ページ: 347-348
巻: - ページ: 41-42
巻: - ページ: 345-346
PLoS ONE
巻: 9 ページ: e101252
10.1371/journal.pone.0101252
Bioorg. Med. Chem.
巻: 22 ページ: 5721-5726
10.1016/j.bmc.2014.09.049
http://lsfb.scc.kyushu-u.ac.jp
http://rsrc.scc.kyushu-u.ac.jp/index.html
