| 研究課題/領域番号 |
25708025
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉村 英哲 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (90464205)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | RNA / イメージング / 1分子観察 / テロメア |
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| 研究概要 |
本研究では、申請者らのグループが開発した、新規プローブを用いた生細胞内RNA１分子イメージング法を用いて、現在注目されている非翻訳性RNAの生細胞内可視化解析を行うことを目的としている。平成25年度は非翻訳性RNAの１つであるテロメアリピート含有RNA（TERRA）を対象に、生細胞内１分子イメージングおよび分子動態解析を行った。
まず、TERRAを特異的に認識し、結合することで蛍光を示すタンパク質ベースプローブを構築した。そのプローブをコードする遺伝子をU2OS細胞内に導入し、細胞内でプローブを発現させた。その細胞を全反射蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、核内にプローブ由来の蛍光輝点の存在が観察された。この蛍光輝点の位置は、固定細胞内でTERRAを相補的拡散により標識したものと良い一致を示した。すなわち、開発したプローブは選択的にTERRAを検出し蛍光を発していることが確認できた。
続いて生細胞内においてプローブ由来の蛍光輝点、すなわちTERRA分子のリアルタイム蛍光観察を行った。その結果、核内で多数の輝点が拡散運動を示している様子が観察された。観察された個々の輝点に対して、輝点追跡を行い軌跡を得た。その結果、拡散運動には自由拡散と閉じ込め拡散の２つのモードが存在することを発見した。さらに閉じ込め拡散は染色体DNAのテロメア領域上で起こることが多いこと、自由拡散運動の中で一過的に閉じ込め拡散を示すことがあることなどを発見した。
以上の結果は、TERRAがテロメア上に形成される複合体と一過的に相互作用することで、何らかの生理機能を発現していることを示唆している。その生理機能の内容と機構について解明することが今後の課題となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度となる平成２５年度では、TERRAの生細胞内１分子可視化に成功した。これは今後の研究を進める上で最も重要な基盤となる成果であり、本研究の今後の発展の元になるものである。さらに、１分子可視化したRNA動態について解析した結果、TERRAが染色体のテロメア領域と一過的な相互作用をするという現象を見いだした。このような現象はこれまで報告されていなかったものであり、世界初の発見である。
これらの成果は、本研究の最終目的であるTERRAの機能発現機構解明を実現するに当たって重要な手がかりとなる技術構築および情報を与える。すなわち、初年度に得られた上記成果は、３カ年にわたる本研究を進めるに当たって、順調な進展を期待させるものである。
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| 今後の研究の推進方策 |
TERRAの生細胞内１分子可視化および動態解析に成功したが、蛍光分子の退色により個々のTERRA分子を追跡できる時間は必ずしも長くない。すなわちTERRAの長時間の動態解析は現状では困難である。また、より多くのデータ数を集めるに当たっても、退色時間の延長が望まれる。
上記課題を解決するために、蛍光観察に用いる励起光の照明方法の改善、より安定な蛍光色素の採用、などの改善を行い、より長時間、より多くの１分子動態データを集められるようにする。また、動態解析プログラムの改善を行い、より精度・検出能の高い動態解析を実現する。
これらの技術的改善を経て、TERRAの１分子動態、とくに染色体のテロメア領域との一過性相互作用について、時空間的な定量データを取得する。得られたデータを統計解析することで、TERRA動態と染色体テロメア領域との相関について考察する。また、テロメア関連タンパク質とTERRAとの同時化しか観察を行い、TERRAの動態と相関のあるタンパク質および生理現象についての考察も行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今後解析プログラムの改良や測定手法の改善のためワークステーションや顕微鏡関連の部品を必要とするが、これらの装置は性能向上のペースが速く、必要となってから購入した方がより性能の高いものを入手できるため、平成２５年度中の購入を見合わせた。
より高精度な顕微鏡関連部品（対物レンズ、焦点追尾装置、検出光路部品等）および解析に必要なワークステーションとプログラムパッケージを購入する。
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