| 研究課題/領域番号 |
25708026
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
高岡 洋輔 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (80599762)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 受容体 / イメージング / サイトカイン |
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| 研究概要 |
本系では、ケモカインや成長因子などのタンパク質性因子（サイトカイン）に対する内在性レセプターが、いつどこで活性化されるかを解析する技術を開発する事を目標として研究を展開する。本年度は、まずサイトカインの人工機能化技術を模索した。その中で、非共有結合的に機能性分子を融合する方法が、サイトカインの機能を損なわないままに、極めて効率的に人工機能化出来る方法であることを見出した。この方法は、サイトカイン、人工分子の試薬を混ぜるだけで様々な機能性分子をサイトカイン上に提示する事ができ、今後のサイトカイン研究に有用なケミカルバイオロジー的手法としての展開が期待される。
また、初年度は、モデルサイトカインリガンドとして、細胞の増殖・成長を制御する上皮成長因子（Epidermal Growth factor, EGF）を選択した。まずはEGFの大腸菌過剰発現系をプラスミドから構築し、これの発現・精製のプロトコルを確立した。ついで、EGFの人工機能化するための化学分子を設計・合成し、これらの分子を用いてEGFの人工機能化を、試験管レベルで最適化する事に成功した。さらに、この機能化EGFを用いて、EGFの受容体である上皮成長因子受容体（EGFR）を生細胞上で選択的に化学修飾する技術を構築した。具体的にはEGFRの過剰発現系をプラスミドから構築し、このモデル細胞を用いて初期的な検討を行った。これらの成果は、次年度以降のEGFRの活性化機構の検出に重要な知見をもたらすものと期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではまずモデル系としてEGF-EGFRというサイトカイン-受容体の組み合わせを用いて、これらの相互作用をリアルタイムにイメージングする技術の確立を目指しており、初年度でこれらのタンパク質を発現するためのプラスミド構築、及び機能化するための指針を確立できた事は、今後の研究展開を見据えた上で重要な進展であったと思われる。特に、EGFのようなサイトカインは低分子量の比較的不安定なタンパク質群であり、これの機能化を、活性を損なう事無く実施する戦略（非共有結合的なin situでの機能化戦略）が整えられた事は、今後のイメージングに置いて重要な知見であった。また、これに対応する小分子機能性分子の合成法の確立も同時に行なっており、本研究の基礎を固める事ができたと期待できる。
一方で、細胞表層で両者の相互作用を蛍光検出するには至っていないため、当初の研究計画の域を超えていないことも事実であり、今後の一層の進展と、ブレイクスルーを目指して研究を展開する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度までに構築したサイトカインの人工機能化技術を用いて、その受容体の化学修飾法の確立を目指す。その上で、前年度までに確立したEGFRの過剰発現系として哺乳類細胞上にEGFRをトランスフェクションする系を利用してEGFRの化学修飾の反応条件（pH、温度、時間、当量数など）をさらに最適化する。これらの検討は、同時に人工機能化する化学分子の設計・合成にフィードバックする事で、分子構造の最適化も合わせて行なう事ができると期待される。さらにこの一連の最適化で得られる化学分子ライブラリーは、今後EGF以外のサイトカインに適用する上でも併用する事ができると考えられる。
次に、内在性EGFRの化学修飾に挑戦する。EGFRは種々のガン細胞に過剰発現している事が報告されており、特に「内在的に発現している」EGFRの、発現量の変化、細胞内への内在化などの動態解析は、多くは間接的に、蛍光修飾したEGFを用いたイメージングが主であった。本研究で実施する、受容体側のEGFRの直接的な動態解析は、医学・生理学分野において重要な研究課題である。そこで本研究で確立するサイトカイン受容体の化学修飾法を用いて、EGFRの動態解析を実現する。具体的には、人工機能化EGFを用いてEGFRの化学修飾を種々の蛍光プローブを用いて生細胞上で行う。これにより、EGFRのリアルタイムイメージングが達成されると期待される。化学修飾されたEGFRは、その後EGF、あるいはそれ以外の内因性サイトカインリガンド分子を用いて活性化し、これを蛍光顕微鏡などの機器を用いてリアルタイムイメージングする事を目指す。EGFRを用いた一連のケミカルバイオロジー、生化学、分子生物学的な研究手法は、今後様々な内在性サイトカイン受容体に研究を展開する上で、極めて重要な知見をもたらすものと考えられる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度はプラスミドの構築およびサイトカインの人工機能化に必要な化合物合成に必要な、生化学、合成試薬類の購入が主であり、高額試薬類の購入は必要なかった。一方で、本年度で構築した技術は今後の哺乳類細胞系での実験計画に繋がり、次年度に必要な血清、抗体類、および蛍光プローブ群などの高額試薬、消耗品類の大量の購入が見込まれたため、次年度使用額が生じた。
上述の通り、次年度は主に哺乳類細胞系での実験が見込まれ、細胞培養に必要な血清類、および生化学的解析に必要な抗体（色素、酵素担持型の抗体を含む）、あるいは様々な励起／蛍光波長を有する高額かつ少量の蛍光試薬類などの高額な消耗品類を使用予定であり、本年度繰り越した費用をこれらに充てる予定である。
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