| 研究課題/領域番号 |
25708026
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
高岡 洋輔 東北大学, 理学(系)研究科(研究院), 講師 (80599762)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 受容体 / イメージング / サイトカイン |
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| 研究実績の概要 |
本系では、ケモカインや成長因子などのタンパク質性因子に対する内在性レセプターが、いつどこで活性化されるかを解析する技術を開発することを目標として研究を展開する。本年度は、前年度までに確立した上皮成長因子（EGF）の人工機能化と、過剰発現系のEGF受容体（EGFR）を用いた特異的なラベル化の結果をもとに、内在性のEGFRをラベル化することに成功した。具体的には、ウェスタンブロッティングによってラベル化反応を検証し、生細胞上でEGF-EGFRの相互作用に基づいたEGFR特異的なラベル化を実現した。さらに、EGFRの活性化機構について重要な知見として、内在性EGFRがEGFによって活性化され、細胞内に内在化（Internalization）を引き起こす様子を、リアルタイムに蛍光イメージングすることに成功した。これまでもEGFRの可視化は行われてきたものの、そのほとんどは蛍光修飾EGF（サイトカインリガンド側）を用いたものであり、EGFRの動態は間接的なものがほとんどであった。本結果は細胞表層のサイトカイン受容体がいかにして細胞内に取り込まれるかを、内在性の受容体を用いて可視化した初めての例となる。
また、本年度は本系の有用性をさらに実証するため、EGFR以外の標的分子として、ケモカイン受容体であるCXCR4を選択した。CXCR4はエイズウイルスの感染の足場となったり、がん細胞上に過剰発現するなど、薬剤標的として近年注目を浴びるターゲットである。このCXCR4のリガンドはSDF1と呼ばれ、ケモカインの代表的な分子であり、過剰発現系等の実績がある。本年度は、このSDFを人工機能化を試験管レベルで達成した。今後、機能化SDFを用いてCXCR4のラベル化、可視化等を目指して検討を重ねる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、まずモデル系としてEGF-EGFRというサイトカイン-受容体の組み合わせを用いて、これらの相互作用をリアルタイムにイメージングする技術の確立を目指しており、本年度までに内在性EGFRの動態解析までを実現することができた。さらなる展開を新たな検討課題として、EGFR以外の標的分子に的を絞り、その予備検討まで実施することができたため、当初の計画通りに進展している。さらなる発展を目指し、内在性ケモカイン受容体の動態観察などを通して、受容体ライブイメージングの革新的な技術として確立していきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度までに構築したサイトカインの人工機能化技術を用いて、内在性の受容体動態観察を実現する強力なツールとして確立する。ケモカイン受容体に焦点を絞り、これの動態観察を行うことで、受容体の局在について重要な知見が得られるものと期待される。標的として挙げたCXCR4は、細胞遊走活性に重要な役割を果たすことが知られており、近年活発に研究がなされている。ただし、内在性のCXCR4が、細胞遊走時にいつどこで活性化されるかを可視化した例はないため、これを実現するため、CXCR4のラベル化条件（pH、温度、濃度、培養条件等）を最適化し、CXCR4の可視化を達成することを目標とする。これらの一連の予想される結果は、ケミカルバイオロジー、生化学、分子生物学的な研究手法を独自に組み合わせた画期的な方法論になるものと期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、元々ある材料を駆使して研究を遂行することができたが、材料が確保できる次年度以降に消耗品や機器（蛍光顕微鏡の周辺機器、HPLCの蛍光ディテクターなど）を購入する事案が生じたため、次年度に一部繰り越すことにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
蛍光顕微鏡の周辺機器については、様々な蛍光波長での検出を目論み、マルチカラーイメージングに本系を適用する。蛍光ディテクターについては、様々な物性の蛍光分子を検討することで蛍光分子の最適化を図るためである。
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