|
コヒーシン複合体は、そのDNAとの結合性が細胞周期の進行に伴って多段階に変化し、それぞれが接着の確立や解除といったステップと密接に関わっている。しかしながらコヒーシンはこれまで、分子集団として観察・解析がなされており、コヒーシン一分子のDNA上 での挙動は明らかになっていなかった。本研究では、DNA上のコヒーシンを一分子レベルで観察する系を確立し、その細胞周期の進行 に応じた挙動を明らかにするとともに、そのダイナミクスを制御するメカニズムを明らかにすることで、姉妹染色分体間接着/解離機構の解明を目指した。本研究では昨年度までに、カバーガラス上に繋留したDNA上に、コヒーシンローダーScc2/4依存的にコヒーシンをロードさせ、それらのコヒーシンを一分子レベルで観察する系を確立した。この系を用いて、コヒーシンがDNA上で一次元自由拡散運動をする様子を観察することに成功した。さらにツメガエル卵抽出液を用いることでDNAをクロマチン化させた系では、コヒーシン の挙動がヌクレオソーム形成位置に影響を受けることを明らかにしてきた。本年度は、さらにこのツメガエル卵抽出液系を応用し、ツメガエル卵抽出液から作製した核抽出液を一分子観察系と組み合わせることで、カバーガラスに繋留したDNAを顕微鏡下で複製させ、複製の進行をリアルタイムでモニターできる系を確立した。この系をもちいて複製中のコヒーシン分子の挙動を観察したところ、複製の進行に伴ってDNA上をスライド、あるいはDNA上から排除される分子が観察された一方、複製通過後も同じ場所に残り続ける分子の存在も確認できた。これらの観察は、DNA複製の進行に依存して確立される接着の分子メカニズムを明らかにする上で、重要な手がかりとなるものである。
|
