| 研究課題/領域番号 |
25711004
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
日野 智也 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (40373360)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / X線結晶構造解析 / 温度受容 / TRPチャネル / 膜タンパク質 / 機能性抗体 |
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| 研究概要 |
温度は、生物の生命活動の恒常性を維持するうえで極めて重要な物理パラメーターである。ヒトでは、30℃を中心として前後15℃程度の範囲を冷感や温感として識別することができ、さらにはこの範囲を超える温度域においては温度感覚とともに痛みの発生を伴う。この温度感覚発生の中心的役割を担うのが非選択的陽イオンチャネルとして機能するTRPチャネルファミリーである。本研究では、ヒトにおける温度感覚の分子メカニズムの解明を目指し、特に低温感知を担うTRPA1および高温感知を担うTRPV1の高分解能結晶構造解析を目的とする。
今年度は、上記2種のTRPチャネルの大量生産系の構築を行った。まず始めに、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いて発現コンストラクトの検討を行った。その結果、TRPA1ではN末端にEGFPを融合させることで、結晶化に十分な発現量が得られた。TRPV1については、N末端約１００アミノ酸残基のフレキシブルな領域の欠損変異体の発現量について検討を行い、アンキリンリピートドメイン近辺まで欠損させても発現量は減少しないことがわかった。次にこれらのコンストラクトを用いて、大量発現を行い、可溶化条件検討、精製条件の検討を行うことで、いずれのTRPチャネルにおいても、機能単位である4量体構造を保持した状態で、結晶化スクリーニングに十分な量の精製が可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TRPV1とTRPA1の大量発現および精製条件を確立し、今後の結晶化や抗体作成のめどが立った。また、TRPV1ではフレキシブルなN末端の欠損変異体を作成することができたため、結晶化の成功に向けて前進していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、来年度はTRPチャネルに対する機能性抗体の作成に取り組む。また、結晶化や抗体作成に要する試料の調製を効率化するために、TRPチャネルの発現量向上を目指し、ピキア酵母を用いた大量発現系を構築する。機能性抗体のスクリーニングは、研究代表者がこれまでに培ってきた技術を用いて行う。具体的には、天然の立体構造提示手法であるリポソームELISA法と変性構造の提示法であるドットブロット法の両者のシグナル比率から、立体構造認識抗体を選抜する。さらにその中から、TRPチャネル発現HEK細胞を用いたカルシウムイメージングにより、TRPチャネルの機能変調作用を持つ抗体を取得する。
得られた抗体のFabフラグメントを調製後、TRPチャネルとの共結晶化に取り組み、結晶構造の解明を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度に必要な設備・備品や消耗品は購入できているので、次年度以降に購入予定の消耗品費として用いるため。
TRPチャネルの精製や結晶化に用いる消耗品の購入に充てる。
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