| 研究課題/領域番号 |
25711020
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
林 良樹 筑波大学, 生命領域学際研究センター, 助教 (30508817)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ショウジョウバエ / 生殖系列 / 解糖系 / ミトコンドリア / 品質管理 |
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| 研究実績の概要 |
個体がもつミトコンドリアは卵を介して母性的に伝達される。正常なミトコンドリアをもつ生殖細胞が選別される仕組みは、次世代の個体が正常なミトコンドリアを受け継ぐ上で重要であるが、そのメカニズムは不明である。本研究では、ショウジョウバエの胚発生過程における始原生殖細胞（以下、PGC）の細胞死誘導が正常なミトコンドリアをもつ生殖細胞を選別するうえで重要な役割を担っているという可能性に着目して研究を行っている。特にPGCにおける解糖系の亢進が、PGCの細胞死誘導を行うことでこの仕組みにおいて中心的な役割を果たしているという可能性に着目している。これまでに１PGCでは体細胞に比べて解糖系中間代謝物質が多く含まれていること、２PGCにおいては解糖系中間代謝酵素をコードする遺伝子（解糖系遺伝子）の発現が高いこと、３解糖系遺伝子の働きはPGCの細胞死誘導に必要であること、４PGCにおいてはマイトファジー因子およびNecrosis誘導因子の発現が高いこと、が明らかとなっている。これらの結果をうけて本年度は以下の研究を行った。
（１）解糖系遺伝子を機能阻害した胚のPGC をセルソーターにより分取し、野生型のPGCと比較することで解糖系およびその他の代謝経路への影響を解析した。
（２）解糖系代謝酵素のタンパク質レベルでの発現を解析するために解糖系代謝酵素遺伝子に対する抗体を作成し、その発現を解析した。特に平成２６年度までに完成しなかったHexokinase（Hex）やPhosphofructokinase（Pfk）等に対する抗体を新たに作成し、その発現を解析した。
（３）PGC中におけるミトコンドリア量を定量的に解析するために共同研究により新たな画像解析法の確立を試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（１）について：解糖系遺伝子の機能阻害胚（HexおよびGapdh1）よりPGCを分取しメタボロミクスに供することでこれら遺伝子の機能阻害がPGCの代謝状態に与える影響を解析した。解糖系遺伝子を母性的に機能阻害した胚は致死率が高く、PGCの分取が困難であった。従来のCE-TOFMS法で行うより検出感度が高いCE-QqQ法を用いることでインプット量を低く保つことを試みた。野生型胚のPGCを用いて条件検討をし、インプットに必要なPGC数の下限を設定することを試み、CE-TOFMS法でのメタボロミクスに用いるPGC数に対し１／１０の分量で行うことで最低限の代謝状態の解析ができる目処をつけた。この実験系を用いて上記の機能阻害胚PGCに対するメタボロミクスを行ったが代謝状態を解明するのに十分な結果を得ることができなかった。
（２）について：これまでに作成することができていなかったHex, Pfk等について、新たに抗体を作成し免疫化学染色に供した。これによりこれらタンパク質の発現パターンを明らかにした。特にPfkについてはこれまでに明らかとなっていた解糖系のプロファイルを一致する発現パターンを得た。Pfkが解糖系初期段階の律速酵素であることを考えるとPGCにおける解糖系代謝プロファイルを決める重要な候補因子であると考えられる。
（３）定量的画像解析を専門とする研究者との共同研究により、免疫化学染色による取得画像からPGC中のミトコンドリア量を定量的に解析する方法の開発を試みた。免疫化学染色の方法、画像取得の方法および画像解析の方法をそれぞれ検討した結果、本解析で用いるのに適した方法について目処がたった。この方法を用いて画像解析を行う矢先に顕微鏡装置の故障で解析の延期を余儀なくされた。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のように解糖系遺伝子の機能阻害によるPGCの代謝状態への影響については明らかにできなかった。これを解決するためにより多くのPGCをインプットとして用いることで解決しようと考える。特に後述のようにPfkがPGCの解糖系プロファイルを決める酵素として候補になったので、この働きを機能阻害した胚を用いることで上記の解析を再解析することを考える。
上記のように解糖系代謝酵素に対するあらたな抗体を作成することにより、解糖系代謝酵素のうちのいくつかについて発現パターンを明らかにした。特に解糖系の律速酵素の一つPfkは初期PGCに高い発現を示し、発生中期以降のPGCにおいては発現が低くなるという結果を得た。Pfkが解糖系の初期段階における律速酵素であることを考え合わせるとPfkはPGCにおける解糖系代謝プロファイルを司る重要な酵素であると考えられる。そこでこの機能を阻害した胚のPGCを中心に代謝プロファイル等を明らかにする。
平成２７年度における大きな成果はPGCにおけるミトコンドリア量を定量的に解析する方法の開発にある。市販のソフトを用いた解析だと１：一つ一つのPGCを分離して解析することができない、２：サンプルの位置により蛍光シグナルの減弱がおこるためにミトコンドリアよりのシグナルを定量化するだけでは正確なミトコンドリア量を計ることができない、という２点が問題となる。この点を解決するため、共同研究により次の方法を確立した。１について：PGCに対するラベルに加えて細胞の中心をマークすることにより、中心と輪郭をもとに一つ一つのPGCを分離する方法を用いた（Region-Growing法）。２：ミトコンドリアのシグナルを、形態をもとに２値化することにより焦点深度の影響を受けない解析方法を確立した。今後はこれを用いることでPGC中のミトコンドリアを定量的に解析することが可能になると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ミトコンドリアの定量的画像解析について、共同研究による解析法の開発のための時間を要し、また解析用顕微鏡等の故障により当該解析の実施が延期されたため。また当初予定していた複数回のメタボロミクス解析が、実験系の再検討によりなされなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度において、当該解析を速やかに開始するとともに、再検討が必要な実験系については他の方法の検討に必要な経費としても使用する。
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