| 研究課題/領域番号 |
25712004
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
有泉 亨 筑波大学, 生命環境系, 助教 (70575381)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 園芸学 / 育種学 / 遺伝子 / 酵素 / 植物 |
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| 研究実績の概要 |
申請者は、エステル化カロテノイドの蓄積に欠陥があり、花弁のクロモプラスト内の顆粒形成が減少した2系統のトマト変異体(pyp1, pyp2)を解析している。両変異体の原因遺伝子は既に同定済みであり、PYP1遺伝子はカロテノイドのエステル化を触媒する酵素で、PYP2遺伝子はエステル化に関わる遺伝子の発現を制御する機能があると推測した。また、エステル化カロテノイドはクロモプラスト内の顆粒形成に必要と推測した。本研究ではこれら推測を実証し、トマト花弁内におけるエステル化カロテノイド蓄積の分子基盤を解明することを目的とする。
本研究ではトマト花弁内のエステル化カロテノイド蓄積の分子基盤を解明することを目的として次の5課題を実施する。①PYP1とPYP2をそれぞれトマト内で過剰発現させた時のエステル化カロテノイド組成・総含量の変化をHPLCで調査する。②PYP1によるエステル化反応の基質となる脂肪酸をガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS)で調査する。③PYP1による脂肪酸エステル化カロテノイド生成能力をin vitroの系で調査する。④Y2H法で同定された因子とPYP2のトマト細胞内での結合能力をBiFC法で調査して、この因子の組換え体を作出し、エステル化カロテノイド合成への寄与を調査する。⑤クロモプラスト内の顆粒を単離して、顆粒内にエステル化カロテノイドが存在する可能性をHPLCで調査する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度では以下の研究を実施した。
（１）前年度にPYP1遺伝子の全長にGFPを融合させたPYP1-GFPを35Sプロモーターの下流に連結したコンストラクトを作成して、pyp1変異体へと遺伝子導入を行なって合計17系統の組換え体を作出していた。そこで本年度は、3系統の形質転換体の後代(T2世代の導入遺伝子ホモ系統)の花弁内のカロテノイド組成・総含量をHPLCで分析した。その結果、形質転換体の花弁においては、野生株とほぼ同程度のカロテノイド組成・総含量を示した。これらの形質転換体の花弁と葯の色も野生株と見かけ上違いはなかった。さらに透過型電子顕微鏡を利用して花弁内のプラスチドの形態を観察したところ、プラスチドの形態および顆粒（プラストグロブリ）形成も回復していたことが分かった。以上の結果を投稿論文として纏めて、The Plant Journal誌にて発表した。
一方、PYP2遺伝子の発現を低下させるアンチセンス用のコンストラクトを構築した。このコンストラクトのマイクロトム野生株への遺伝子導入を開始した。
以上、ほぼ計画の予定通りの研究が完了した。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜平成27年度＞
（１）PYP1のカロテノイド(ネオキサンチン)へのエステル化触媒能力を明らかにするために、全長のPYP1遺伝子を、キサントフィルを産生する大腸菌内で発現させて、PYP1がエステル化キサントフィルを直接生成する能力があるかを明らかにする。（２）PYP1タンパク質の局在性をより明らかにするために、percollでプラスチド画分を単離して、GFP抗体によりPYP1がプラスチドの局在するのかをウエスタンブロット分析で明らかにする。次に、PYP1-GFPを遺伝子導入した形質転換体を利用して、GFP抗体による免疫電顕を実施してPYP1タンパク質の細胞内局在性を明らかにする。（３）PYP2遺伝子の発現を抑制するコンストラクトをマイクロトムに遺伝子導入して、組換え体を得る。また、組換え体の花弁の色が変化するかを調査する。（４）PYP2遺伝子と相互作用する遺伝子の機能解明を進める。
＜平成28年度＞
花弁のクロモプラスト内において、エステル化カロテノイド合成が顆粒形成に重要であることを証明するために、WT、pyp1、pyp2、pyp1 pyp2変異体、あるいは得られた形質転換体の花弁よりこの顆粒を単離して、HPLCでエステル化カロテノイド組成・総含量を測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は主に組換え体の解析を実施した。HPLCによるカロテノイド分析に必要な試薬類は共同研究者と共同して負担したため予想よりも支出が少なかった。また、備品の購入においては、共同研究者が保有する機器を利用して実施したため、購入を見送っていた。その上、学会発表が国内の1件に留まり、海外での発表を見送った点も次年度使用額が生じた理由としてあげられる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度は多数の組換え体を作出して解析する必要があるため、実験補助および非常勤研究員を雇用して研究の強化に充てる。繰り越し金の多くはこの経費に充てる予定である。また、PYP2遺伝子の解析において論文を執筆してその印刷費に用いる。海外での学会発表等も精力的に実施する。
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