| 研究課題/領域番号 |
25712004
|
|---|
| 研究機関 | 筑波大学 |
|---|
研究代表者 |
有泉 亨 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (70575381)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 園芸学 / 育種学 / 遺伝子 / 酵素 / 植物 |
|---|
| 研究実績の概要 |
申請者は、エステル化カロテノイドの蓄積に欠陥があり、花弁のクロモプラスト内の顆粒形成が減少した2系統のトマト変異体(pyp1, pyp2)を解析している。両変異体の原因遺伝子は既に同定済みであり、PYP1遺伝子はカロテノイドのエステル化を触媒する酵素で、PYP2遺伝子はエステル化に関わる遺伝子の発現を制御する機能があると推測した。また、エステル化カロテノイドはクロモプラスト内の顆粒形成に必要と推測した。本研究ではこれら推測を実証し、トマト花弁内におけるエステル化カロテノイド蓄積の分子基盤を解明することを目的とする。
本研究ではトマト花弁内のエステル化カロテノイド蓄積の分子基盤を解明することを目的として次の5課題を実施する。①PYP1とPYP2をそれぞれトマト内で過剰発現させた時のエステル化カロテノイド組成・総含量の変化をHPLCで調査する。②PYP1によるエステル化反応の基質となる脂肪酸をガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS)で調査する。③PYP1による脂肪酸エステル化カロテノイド生成能力をin vitroの系で調査する。④Y2H法で同定された因子とPYP2のトマト細胞内での結合能力をBiFC法で調査して、この因子の組換え体を作出し、エステル化カロテノイド合成への寄与を調査する。⑤クロモプラスト内の顆粒を単離して、顆粒内にエステル化カロテノイドが存在する可能性をHPLCで調査する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度では以下の研究を実施した。
（１）PYP2遺伝子の候補遺伝子を1つ既に同定していた。そこで、PYP2遺伝子の発現量を低下させるアンチセンス用のコンストラクトを構築し、このコンストラクトのマイクロトム野生株（WT）への遺伝子導入を行った。20系統の組換え体を作出したところ、8系統において花弁、葯における着色の低下が見られた。この表現型はpyp2変異体と同様であることから、この遺伝子が原因遺伝子である可能性が強く示唆された。現在、PYP2遺伝子の発現量及びカロテノイド分析を行うため、独立の3つのT0世代における花弁と葯のサンプリングを実施している。
（２）マイクロトム野生株、pyp1変異体の2つのアリルpyp1-1、pyp1-2、pyp2変異体の2つのアリルpyp2-1、pyp2-2、及びpyp1/pyp2二重変異体において、葯におけるカロテノイド分析を行った。その結果、変異体では野生株と比較して花弁と同様にカロテノイド総含量が低下した。
（３）PYP1にGFPを融合させた融合タンパク質（PYP1-GFP）を35Sプロモーターで、pyp1-2変異体内で過剰発現させて、表現型が回復した組換え体を得た。次にPYP1タンパク質の局在性を明らかにするため、PYP1-GFP融合タンパク質の局在性実験を行った。具体的には、生育3週間後程度の組換え体の全身から全タンパク質を抽出し、percollでプラスチド画分を単離して、GFP抗体によりPYP1がプラスチドに局在するのかをウエスタンブロット分析で調査した。その結果、percollにて分離したプラスチド画分にPYP1-GFP融合タンパク質の局在を確認した。次に、PYP1-GFPを遺伝子導入した形質転換体を利用して、GFP抗体による免疫電顕を実施したところ、PYP1-GFP融合タンパク質は花弁細胞内のプラスチド（クロモプラスト）内に分布しており、特に顆粒（プラストグロブリ）周辺に局在することがわかった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
（１）PYP1のカロテノイド(ネオキサンチン)へのエステル化触媒能力を明らかにするために、全長のPYP1遺伝子を、キサントフィル（ビオラキサンチン）を産生する大腸菌内で発現させて、PYP1がエステル化キサントフィルを直接生成する能力があるかを明らかにする。具体的には、ビオラキサンチンの産生を誘導するプラスミドとPYP1遺伝子にHisタグを結合させた融合遺伝子を共に同一の大腸菌へと形質転換し、この２つのプラスミドが導入された大腸菌を培養し、菌体中でビオラキサンチンがエステル化されているかを明らかにする。エステル化カロテノイドの存在は、けん化処理を施したサンプルと、けん化処理を行わないサンプルをHPLCで比較して明らかにする。また、ガスクロマトグラフィーを利用してエステル化された脂肪酸についても明らかにする。
（２）花弁のクロモプラスト内において、エステル化カロテノイド合成が顆粒形成に重要であることを証明するために、WT、pyp1、pyp2、pyp1 pyp2変異体、あるいは得られた形質転換体の花弁よりこの顆粒を単離して、HPLCでエステル化カロテノイド組成・総含量を測定する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は主に組換え体の解析を実施した。HPLCによるカロテノイド分析に必要な試薬類は共同研究者と共同して負担したため予想よりも支出が少なかった。また、備品の購入においては、共同研究者が保有する機器を利用して実施したため、購入を見送っていた。平成27年度では植物栽培に関わる経費が生じたものの、分子生物学的実験に利用する消耗品での支出が予想より低く、繰越金が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
来年度は、多数の組換え体及び変異体の育成が必要であるため、実験補助および非常勤研究員を雇用して栽培の強化に充てる。繰り越し金の多くはこの経費に充てる予定である。また、現在論文を執筆しているため、その印刷費に用いる。また、論文投稿後、学会発表等も精力的に実施する。
|
