| 研究課題/領域番号 |
25712012
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
士反 伸和 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20547880)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アルカロイド / 転流 / タバコ / ニコチン / トランスポーター |
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| 研究概要 |
植物は外敵から身を守るため、アルカロイドなど生理活性物質を生産する。これら物質は特定の器官やオルガネラに蓄積されるが、その輸送機構の全容は未だ明らかとなっていない。本研究では、根で生合成され葉に蓄積するタバコのニコチンアルカロイドをモデルとして、輸送体を介した根から葉へのアルカロイド転流の包括的解明を目指している。
①葉におけるニコチン取込み機構の解明 根におけるニコチン輸送体の基質特異性を解析した。また、同じ輸送体ファミリーに属する複数遺伝子の組織発現をリアルタイムPCRにより明らかとした。さらに、葉において発現する分子種について、部分配列の同定も行った。別の輸送体ファミリーに属する輸送体が葉の取り込みに働く可能性も考え、ジャスモン酸処理の有無の葉を用いたマイクロアレイを行い、有意に発現変動している膜タンパク質もクローニングの候補とした。
②根からのニコチン排出機構の解明 タバコ植物の水耕栽培の系を確立することに成功した。育てた植物より根をサンプリングし、タンパク質抽出を行った。ここで得られたベシクルをニコチン、ATPとともに一定時間25℃で処理し、ベシクル内へのニコチン輸送を検討した。
③各種輸送体の形質転換植物、培養細胞の作出 各種輸送体の遺伝子をアグロバクテリウムに導入し、タバコを形質転換することで毛状根を作出した。遺伝子が導入されていることはゲノムPCRにより確認済みである。現在、タンパク質レベルでの発現変動の確認を試みている。
④形質転換体のアルカロイド含量の定量 すでに作出していた形質転換体を植物培養装置内で育ててサンプリングし、根、茎、葉からアルカロイドを抽出した。その後、各組織におけるニコチン含量をHPLCにより定量した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度としてリソースの作成や、すでに作成したリソースの解析がほぼ予定通り進んだため。それら解析から得られた結果は近日中に論文として投稿を予定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
①葉におけるニコチン取込み機構の解明 葉における輸送体候補の全長をクローニングすると共に、その輸送能や細胞内局在などを解析する。
②根からのニコチン排出機構の解明 根における輸送として、ベシクル輸送の解析を進めるとともに、排出輸送体の候補であるJAT1を過剰発現する毛状根の作出と解析を行う。
③各種輸送体の形質転換植物、培養細胞の作出 各種輸送体の過剰発現、発現抑制した毛状根の作出をさらに進めるとともに、①で単離した新規輸送体の形質転換植物、培養細胞などを作出する。
④形質転換体のアルカロイド含量の定量 ③で作出した形質転換体について、タンパク質レベルでの発現変動、アルカロイド含量の変化を定量的に解析する。
H26年度より研究員を一名雇用し、これまで以上に解析を効率的に進めていく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究員を早くから雇用する予定であったが、人選の結果として、本研究内容への知識や技術的な経験・能力において最良と判断した方が学位取得前であったため、雇用時期が次年度に持ち越されたため。研究自体は、学生との実験によりリソース（形質転換体など）の作成などが順調に進んできたため、次年度においてリソースの解析を研究員とともに素早く進める予定でいる。
研究員および実験補助員を雇用し、作出した多くのリソースの選抜と解析を迅速に進める。これら人員の雇用に大きな費用を必要とするとともに、解析にかかる消耗品の購入に使用する。
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